RabMAb® 兔单克隆抗体技术网络研讨会介绍

聆听 RabMAb 技术创始人朱伟民先生介绍兔单克隆抗体技术。

RabMAb® 技术是 Abcam 独家的兔单克隆抗体技术。该技术结合了兔抗体的卓越抗原识别能力和单克隆抗体所具有的特异性和一致性。

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了解为什么选择 RabMAb® 技术:

  • 与传统抗体相比,亲和力更高、特异性更强
  • 与传统抗体相比,背景信号通常较低
  • 识别多种抗原表位
  • 研究小鼠模型的理想之选
  • 是要求严苛实验应用的理想之选,例如对石蜡包埋(FFPE)组织进行的 IHC。


主讲人简介:

朱伟民先生在中国厦门大学获得细胞生物学硕士学位。他曾任浙江医科大学病理研究所高级研究员,开始单克隆抗体的研究。他后赴加州大学圣迭戈分校任高级副研究员,开创了兔单克隆抗体技术的开端(构建出新的兔融合伴侣 240E-W),并成功建立了生产兔杂交瘤的大规模系统。

利用这项技术,他带领团队开发出多种高质量的兔单抗,鉴定了多种癌症特异性分子。朱先生曾发表 20 余篇文章,且拥有多项专利。


讲座视频脚本:


大家好。

谢谢 Lucy 的精彩介绍,也感谢各位参加本次 RabMAb 网络研讨会。

刚刚 Lucy 也介绍过,我是在加州大学圣迭戈分校开始研究兔单克隆抗体技术的。我相信当时应该只有一小部分人了解这项技术。即使是在几年后,当我在一次大会上发表兔单克隆抗体的演讲时,仍然有许多人不了解这项技术,总是将其与兔多克隆抗体混淆。

现在,17 年过去了,我很高兴看到这项技术广为人知,市场上的 RabMAb 产品也已经多达数千种。

今天,我想在这里和各位分享一下这项新技术以及它的优势。希望能够对各位的研究有所帮助。

我打算围绕以下三个话题进行介绍——为什么选择兔子,这项技术是如何开发出来的,以及第三,这种新型抗体的好处或优点。我还会与各位分享几个例子。事实上,每一个话题都需要一次完整的网络研讨会才能讲完。我今天只能简要谈一谈每一话题,提一下主要内容。所以,这次网络研讨会会比通常的时间要长一点。

我想在此提前感谢各位的参与。那我们开始吧。

目前有五大已知的抗体制备平台。单克隆抗体是最常用的抗体,其市场占比超过了90%。兔单克隆抗体与小鼠单克隆抗体有些相似,而且与小鼠单克隆抗体一样常用。此项优秀的技术采用了 PCR 克隆分子技术生成抗体,我们可以看到这种技术主要用于治疗应用。

鸡和山羊是多克隆,主要用于二抗。有些已发表的文章中提到通过异种杂交瘤方法得到了鸡单克隆抗体和羊单克隆抗体。但是市场上很少见,而且我认为这些抗体还处于研发阶段。

兔多克隆抗体的使用已超过 100 年。事实上,由于质和量的问题,在单克隆抗体技术出现之前,兔多克隆抗体是主要的研究试剂。在二十世纪九十年代末,兔单克隆抗体技术的出现改变了研究局面。

众所周知,使用兔子得到的多克隆抗体亲和力高,而单克隆抗体虽然特异性不错,但总的来说,它的亲和力没有那么好。因此,兔单克隆抗体技术,也就是 RabMAb,能够将兔子免疫系统的天然优势与单克隆抗体的特异性和一致性结合起来。它成为了继小鼠杂交瘤技术平台之后一个更新更好的抗体平台。

接下来,我将针对支持这一观点的科学证据和数据进行详细说明。

兔子有 18 种不同的品系。实际上更多,这里只展示了 18 种。它们看上去都很可爱。要制备兔多克隆抗体或单克隆抗体,我们通常使用的是新西兰白兔。

下面我将花点时间讲一下兔 B 细胞免疫,这对于解释选择兔子的原因很重要。虽然根据经验,对于许多抗原而言,通过兔子制备的抗体通常比啮齿动物的质量更高。原因尚未明确。兔的免疫学研究最新进展为我们提供了一些答案。大家都知道,B 细胞的抗体谱系的形成分为两个阶段。一抗谱系的形成在动物遇到前抗原时就开始了,通常在骨髓中发生,通过 VDJ,或 VJ 排列。但是,兔子的 B 细胞会在阑尾或其他肠相关淋巴样组织,也就是 GALT 中继续发育,通过非常缓慢的基因转换来继续增加抗体谱的多样性和抗体库的规模。小鼠、大鼠以及人类都没有这种基因转换机制。这是兔子特有的。

基因转换是抗体成熟的一个新机制。不同于超突变,它借用了上游 VH 基因,或者追寻该基因,增加了抗体突变区域的多样性。更多信息,请参考我书中的具体章节,我已将其列在最后一张幻灯片上。

此外,兔子一抗谱系在出生后六到八周继续形成,而小鼠或大鼠则在出生后停止。这些都有助于在兔子中形成比小鼠免疫系统更大的一抗谱系,多样性更广。针对兔免疫系统的独特特征,我在这里提供两条制备兔抗体的操作建议。

第一,我不建议在无菌动物设施中养兔子,因为阑尾中的肠道菌群对于一抗谱系的形成至关重要。

第二,我不建议使用小于六周龄的兔子制备抗体,因为,就像我说过的,小于六周时,兔子的抗体谱系仍处于发展阶段。

二抗谱系在兔子遇到外源抗原后开始形成。B 细胞从阑尾移动到次级淋巴组织,例如脾脏和淋巴结。基因转换或体细胞超突变在这些器官的生发中心进行,这引起了抗体成熟,可以选择亲和性极高的抗体,因为兔子的亲和力成熟周期很长。

此外,CD1 是抗原提呈分子的进一步分支,与 MHC1 MHC2 不同。CD1 仅提呈脂质和糖脂类的抗原。科学家发现,兔子的 CD1 家族比小鼠更大。兔子有五种 CD1 同型,而小鼠只有一种。我认为,这或许解释了为什么根据人们的经验从分子水平来说,与小鼠相比,兔子对脂质和糖脂等难度较大的抗原产生的抗体质量更好。

好的。这里是兔子独特特性的一个总结,这些特性使得兔抗体比小鼠抗体质量更好。那么,我刚刚也提到了,兔子有独特的 B 细胞发育过程,还有双重亲和力成熟机制,也就是基因转换和超突变。而小鼠只有一个机制,也就是超突变。而且,兔子有更全面的脂质和糖脂抗原提呈。

此外,兔子的 IgG,具有一些独特的特性。众所周知,小鼠和人有四种 IgG,而兔子只有一种 IgG,没有其他亚型,例如 IgG1IgG2IgG3。而且,兔子的 IgG 往往有更多的二硫键。兔 IgG CDR 区和轻链的结构更复杂,有助于抗体亲和力。所以,这些特性共同造就了兔免疫系统,使其与小鼠的免疫系统不同。由于兔子具有的 B 细胞谱系更大、多样性更高,给我们提供了更好的机会来选择质量更高的抗体,例如亲和力更高、特异性更强、表位识别更广泛。

这里,我展示了一些简单的实验,比较兔和小鼠对同种抗原的免疫反应。基本上,我们将人纤连蛋白注射到兔子和小鼠中,然后利用抗血清对纤连蛋白片段进行蛋白质印迹分析,看它们能检测到多少条带。数据显示,在兔子中识别的条带——蛋白质条带比小鼠更多。大家可以看到这个——右边,可以看出兔子比小鼠识别的表位更多。

我们还做了另一个实验来比较兔子和小鼠。我们将 KLH 偶联肽注射到兔子和小鼠体内。分别检查它们对 KLH 和肽的免疫应答。可以看到,小鼠中,大多数应答是针对 KLH 的,在 90% 左右,这是起作用了,因为 KLH 具有很强的免疫原性。但是在兔子中,对 KLH 的应答要弱一些,在 70% 左右,对肽的应答要强一些。

我相信,大多数人都会选择兔子作为制备肽抗体的动物。原因是兔子可以生产的多克隆抗体数量更大,而且对肽的抗体质量更好。肽是小鼠中的一种表位类型。当我们在考虑针对蛋白修饰位点制造抗体时,如磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化,兔子的优点就尤为重要了。

好的,我们来看第二个话题,RabMAb 技术的历史。

科学家们都知道,兔子的多克隆抗体质量好。二十世纪七十年代大多数杂交瘤技术问世,人们已经通过多种方法尝试制备兔单克隆抗体。但是都没有成功,因为兔不像小鼠会自然发展出骨髓瘤病。因此不能得到用于制备兔杂交瘤的骨髓瘤融合伴侣细胞系,也就无法制作兔单克隆抗体了。

直到 1995 年,芝加哥洛约拉大学的 Katherine Knight 博士在 PNS 上发表了一篇文章,介绍兔单克隆抗体技术。利用的是名为 240 E1 的融合伴侣细胞系,这是经过她的团队 10 年努力从两个致癌基因的转基因兔中开发出的。但是,从杂交瘤得到的 240 E1 的稳定性很差,在细胞多次传代后经常会丧失抗体活性。当时许多实验室也鼓励机构合作伙伴尝试制造兔单克隆抗体,但他们都失败了。

1996 年,我和 Robert Pytela UCSF 也得到了这个细胞系,遇到了跟其他实验室相同的问题。但我们没有放弃。我们花了近一年时间重新设计这个细胞系,特别幸运地是,我们开发出了一个新的融合伴侣细胞系 240 E-W,具有高融合效率和可靠的杂交瘤稳定性。

从那以后,兔单克隆抗体技术就成为了一项常规实验室技术。有了新的——这一新的融合伴侣细胞系,我自己和另一位——以及其他完全创始人在 2001 年成立了 Epitomics。我们继续改进这一核心技术,并开发出了更好版本的融合伴侣细胞系,即 2005 年推出的 240 E-W2 2009 年的 240 E-W3

我们拥有这项技术的全球独家知识产权。

Abcam 全球独享这一技术。这一新的融合伴侣细胞系,240 E-W2240 E-W3,让我们能构建出像制造小鼠单克隆抗体的小鼠融合伴侣细胞系 FP20 那样的兔杂交瘤。这确实为科研界和生物技术行业打开了新世界。

制造 RabMAb 的步骤与制造小鼠单克隆抗体很相似,也就是大家都知道的杂交瘤方法。关键是需要有兔融合伴侣细胞系 240 E-W。兔 IgG 和小鼠以及人的 IgG 相似,但正如我刚刚说的,兔子只有一种 IgG,通常存在额外的二硫键以实现多变性和轻链的稳定域。

一些人认为,这些额外的二硫键有助于兔 IgG 的稳定性。从公司成立以来,我们的开发方向不再局限于 240 EW 融合伴侣。事实上,我们建立了稳健的 RabMAb 开发和生产体系,包括免疫接种设计、制备、筛选设计、RabMAb 工程及更大的 RabMAb 生产系统。形成了一整套完整的体系。

有了这一强大的支持,我们已经在研发过程中研究了 15,000 种免疫原。在诊断领域,我们已经合作启动了诊断级抗体生产,制造 FDA 批准的 1 级或 3 RabMAb 产品用于上市。在治疗领域,人源化兔抗体现已进入1期临床试验阶段。

还有几种处于临床前开发阶段的研发。依靠我们的专利技术,我们还可以提供定制服务。

目前我们为约 700 家大学、研究所和公司提供服务。这些数字也说明了RabMAb 技术是一项经认可的领先技术。而且,我们推出产品时的标准和要求也很严格。比如蛋白质印迹,我们推出的产品必须是在空白细胞裂解液或组织中适当分子量处跑出单一条带的。蛋白质印迹的最低稀释度为 1:1,000。我们会采取五种检测方法对每种产品进行测试,我们还会检测种间交叉反应性,例如人、小鼠、大鼠。

说到抗原,接下来介绍一下 RabMAb 的优势。对于小鼠无法产生高质量抗体的表位,兔子可以成功识别。这也是我们正在做的事情,以及我们在抗体,IHC 应用的抗体,啮齿动物蛋白的 RabMAb 开发方面的努力。以及利用 RabMAb 来开发抗体对。

这些是——右边是我们今后会着重关注的领域,构建非蛋白靶标的抗体,例如脂质或糖脂、水合铜、或者构建构象表位的 RabMAb,例如 CTCR,以及蛋白-蛋白相互作用的新表位。

好,这些就是 RabMAb 技术开发历史的要点。1995 年,Katherine Knight 博士构建了第一代兔融合伴侣,为兔单克隆抗体技术打下基础。我们付出了巨大的努力,构建出了新的融合伴侣细胞系,让 RabMAb 技术成为常规技术,广泛用于生命科学、诊断、治疗。作为一名技术研发人员,我真心希望这一新技术能造福越来越多的科学家和人类健康。

好吧。那么,第三个话题。

RabMAb 的优点。这些是我们已经提到过的主要优势。

简言之,与大多数单克隆抗体相比,RabMAb 有高亲和力和特异性。它能更广泛地识别表位并聚焦更小的表位,例如翻译后修饰位点、蛋白裂解位点、突变位点、或者构象表位。这些是 RabMAb 比小鼠单克隆抗体表现更好的领域,例如 IHC、构建啮齿动物蛋白抗体的免疫组织化学应用、非蛋白免疫抗体、用于抗体配对或多重免疫测定。

好,在接下来的幻灯片里,我将分享几个例子,说明 RabMAb 的优点。那么,这是 KD 测定数据。我们测量了约 1,000 RabMAb KD。在左边——这些是我们在已发表文献中找到的小鼠单克隆抗体 KD

那么,我们进行了对比,发现总体来说,RabMAb 比发表文献中的小鼠单克隆抗体的亲和力高了 10 100 倍,我们可以——嗯,各位可以在我们的网站 www.abcam.com/kd上找到 KD 测量的更多信息。

高亲和性。在病理实验室中 RabMAB 得到普遍认可,是 IHC 的最佳试剂。对于许多重要的生物标记物而言,RabMAb 已经取代小鼠单克隆抗体,占据了主要市场份额。该数据显示,与兔多克隆抗体和小鼠单克隆抗体相比,RabMAb HER2 更多。我们可以实现高灵敏度的染色而没有背景染色,这也是每个病理学家所期待的。

那我想在此指出的是,这并不是个例。我已经看到了很多 RabMAb 产品都得到类似结果。

高特异性,此处数据来自一位斯坦福教授。他用蛋白质印迹对 RabMAb 与一种市售抗体进行比较,测试了八种不同的细胞系,而 RabMAb 只测出一条特异性条带。我想再次指出,这并不是个例。

好,这是个有趣的数据。蛋白质裂解位点的抗体。这些裂解位点是新的表位,只在蛋白裂解后才会出现或者暴露。在这里,细胞凋亡过程中,全长 PARP 被半胱天冬酶切割。在实验中,我们构建了两种 RabMAb,可检测 25 KD 85 KD 的新切割表位。还有一种 RabMAb,能检测全长 PARP。构象表位,在这个例子中,没有发生氨基酸改变或者蛋白修饰。这里的唯一变化就是蛋白质 3D 结构的变化。

Hck 处于激活状态时,这个新表位就暴露了。我们构建了一种 RabMAb,可特异性检测这一构象表位。

非蛋白靶标 PEG。正如我之前说的,兔子的脂质或糖脂类抗原完整提呈系统可以解释为什么我们能为聚合物、脂质等困难靶标构建具有高亲和性或特异性的抗体。大部分时候,如果我们注射这种抗原,最后会得到 IGM 抗体。一个克隆的 RabMAb 可用于多种用途。

许多 RabMAb 都可以用于多种用途,我们进行了一些统计分析,发现我们 85% RabMAb 抗体可用于两种及以上的用途,62% 可用于三种或以上的用途。

好的,下面我进行一下总结。重要的信息有:

总体来说,与小鼠单克隆抗体相比,RabMAb 的亲和力和特异性更高。

第二,利用 RabMAb 技术,我们可以构建新表位或者困难抗原的抗体,而小鼠可能无法为此提供高质量的抗体。

第三,利用 RabMAb 技术,可以构建人类蛋白的啮齿动物蛋白交叉反应抗体,而且用 RabMab 构建啮齿动物蛋白时具有明显优势。

RabMab 技术是一项经认可的领先技术。RabMab 产品经过充分验证,可用于多种应用。

我希望各位在考虑制备抗体时,将兔作为首选的动物物种。在考虑研究用的抗体时,RabMab 将会是一种高质量的首选试剂。此外,我真心希望刚刚分享的这些科学原理和科研数据已经说服了各位。

在稍后的 RabMab 和最新产品介绍后,我非常乐意回答各位的问题。

女主持人:大家好。感谢 Weimin 给我们带来的精彩演讲。我想借此机会向各位介绍一下我们的产品,可能会对您的研究有所帮助。

首先,我想再次强调我们的 RabMab 产品范围及其优势。RabMab 是目前最高质量的抗体。各位可直接从 Abcam 获取。它们具有多种优势,既有高亲和性和特异性又有多样的表位识别。每一种 RabMab 都经过多种物种和多种应用的验证,例如蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫荧光、免疫沉淀和流式细胞术。当然,每种产品都承载了我们的承诺,确保产品质量和专业的客户支持。

您是否需要为难以表征的靶标构建抗体?或者,您希望构建磷酸化或其他修饰的特异性抗体?现在,Abcam 为客户提供单克隆抗体的在线服务。我们的定制抗体开发流程很灵活,专为您的具体需要和需求量身定制。

我们提供的服务有:兔单克隆抗体和兔多克隆抗体构建、免疫原设计与制备、免疫测定法的开发、IgG cDNA 克隆、以及大规模抗体生产。我们的项目经理随时准备为您提供帮助。他们可以在整个项目过程中提供定期更新和技术协助。我们的定制抗体团队有令人瞩目的成功记录,帮助客户成功构建 RabMAb。超过 550 家研究所和 150 家制药公司以及生物技术公司已经从我们的定制 RabMAb 中受益。

在我们的 abcam.com/customservices 网页上可以看到定制 RabMAb 相关的文献引文和不断增加的客户感言。另外,我还想向各位介绍一下 RabMAb 以外的其他产品。我们的产品目录包含了用于免疫组织化学实验的全系列产品,例如我们的 EXPOSE IHC 试剂盒,提供的灵敏度比聚合物和 ABC 检测系统更高。这是通过EXPOSE IHC 试剂盒里的一种较小的检测复合物实现的。

在我们的 IHC 产品组合中,各位可以找到生物素、链霉亲和素试剂盒、小鼠对小鼠 IC 试剂盒,以及其他各类试剂。如果您想了解更多信息,请访问 abcam.com/IHC。欢迎下载 IHC 应用指南,助您规划和优化实验。

或者,您对蛋白质印迹更感兴趣?您可以在 abcam.com/optiblot 下载提示手册,找到各类试剂优化蛋白质印迹,包括保质期长的凝胶、Optiblot Blue、鲁米诺发光笔、转膜、高灵敏度 ECL 试剂盒、荧光检测试剂等。

如果您喜欢用二抗,我们推荐这一款 Alexa Fluor 偶联二抗。这些二抗都已在 Abcam 实验室经过充分检测,保证了明亮的染色和较低的背景。我们 QC 时一定会进行仅使用二抗的对照,以确保在二抗最低背景染色下的特异性。预吸附抗体的选择范围较大,以确保物种交叉反应程度较低。所有产品的稀释度介于 1/200 1/1,000 之间,而且产品价格非常优惠。

了解更多信息,请访问 abcam.com/Alexa。现在,我想把话筒交回 Weimin,他将进行答疑。

Weimin Zhu: 好。我收到了很多问题,下面我将逐一回答。

第一个问题,你提到RabMab最低推荐稀释倍数为 1/1,000。那最高呢?

这是个好问题。事实上在早期,大概是九年前,实际上——我为斯坦福教授构建了一种抗体。当时的最大稀释度,我想应该是 1/1,000,000。所以,实际上我们大多数产品确实——即使采取很高的稀释度也能实现明显优于小鼠单克隆抗体的结果。

第二个问题是,降低蛋白质的用量后,从兔单抗得到的信号是否仍然良好?举个例子,如果小鼠单克隆抗体需要 30 40 微克的细胞裂解物,那么兔单克隆抗体只需要 10 20 微克,这可能吗?

是的,我认为答案是肯定是,正如我所说的,这只与抗体的亲和性有关。那正如我之前提到的,一般而言,RabMAb 的亲和性是小鼠单克隆抗体的 10 100 倍。所以我认为样品减少的话,您还是能得到相同的条带信号。

第三个问题是,在其中一张幻灯片中你提到了 KD 值,什么是 KD

好的。我会跳过这一题。因为它需要我再花 10 分钟来回答。您可以访问我们的网站 www.abcam.com/ckd。上面有很详细的解释。

最后一个问题。我想知道有没有对猪具有特异性的 RabMAb

没有,我们没有,但是我相信,你知道,如果您有从这些物种得到的蛋白,我们可以为您构建更强抗体,因为就质量而言,RabMAb 比常用的小鼠单克隆抗体要好。所以,即使是有来自其他物种的靶标,我相信我们也有很大的成功机会。

谢谢大家。

About the presenter

Mr. Weimin Zhu received his M.S. in Cell Biology at Xiamen University, China. He was a Senior Research Fellow at the 


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