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IHC ICC staining techniques

单标记和多标记 IHC/ICC 染色技术网络研讨会

观看由我们 IHC/ICC 专家主讲的自选网络研讨会 

本次研讨会将概述让您从实验中获得最佳结果的诀窍和技术,帮助您克服常见的技术难题。 

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网络研讨会主题

  • 使用抗体进行逐步染色
  • 使用抗体进行同步染色
  • 使用抗体和细胞标记物的多重染色
  • 图像分析和验证

主讲人简介

Simon Renshaw,Abcam 高级成像科学家。


网络研讨会翻脚本

大家好,欢迎参加 Abcam 的在线讲座“单标记和多标记 IHC/ICC 染色技术”。今天的主讲人是 Abcam 资深成像研究员 Simon Renshaw。Simon 在英国布拉德福德大学修完生物医学学位。之后,在英国剑桥阿登布鲁克医院的组织病理科完成了 BMS1 培训。在那里,他使用免疫组织化学和免疫荧光技术来进行诊断。2001 年,Simon 加入了 Abcam。

今天与 Simon 一起进行讨论的还有 Abcam 的产品经理 Judith。Judith 在邓迪大学取得了分子生物学学士学位和博士学位。完成学业后,Judith 就去了英国剑桥的 MRC 分子生物学实验室,她在 2011 年加入 Abcam。

给大家说明一下,当您退出该在线讲座时,界面就会跳转至 PDF 下载页面,供您下载。现在,就有请 Simon 开始今天的在线讲座。

SR:谢谢Lucy。大家好,欢迎大家参加“单标记和多标记 IHC / ICC 染色技术”的 Abcam 在线讲座。正如标题所示,我将跟你们分享关于单标记和多标记免疫染色时必须考虑的主要因素和步骤。讲座之后,我会给大家出三个有趣的小问题,大家可以留意一下!

开讲前,向大家推荐一个在线讲座:通过认真的实验设计优化 IHC 和 ICC 结果。该讲座涉及 IHC 和 ICC 实验设计的许多重要方面,在 Abcam 博客里,可以看到这个视频。今天的在线讲座将侧重于介绍免疫染色的实际操作,包括单标记和多标记。不过,考虑到讲座的完整性,我将会适当地重新提到一些实验设计统计相关的内容。

我们会对以下内容进行详细讨论。首先,使用单标记的IHC/ICC 染色实验方案一般是两天。第一天包括热抗原修复和酶抗原修复、缓冲液和去垢剂、封闭剂、以及一抗孵育。第二天包括封闭内源过氧化物酶、检测系统、讨论是使用酶标还是荧光标记,以及酶检测系统的各种色原。然后,我们将继续讨论复染试剂,以及最后一步,封片。如果你想了解,我会在多重染色部分讲讲荧光复染。在讲座的第二部分,我们来探讨多重染色的 IHC 和 ICC,从荧光染色的原理开始,接下来我们来对荧光标记和酶标进行比较,讨论荧光标记的组合、同步染色、逐步染色,最后谈谈对照。

首先,我们来介绍适用于二抗、聚合物或亲和素-生物素复合物的通用 IHC / ICC 实验方案。您可能在之前的在线讲座中也了解过,根据您的实验设计,每一步都有诸多变化。我将具体讨论每一个实验步骤,必要时,还将探讨一下常见的实验设计变化。此次在线讲座最后部分的重点是多标记实验设计。

我们来快速过一下实验方案,对后面内容有一个大概印象。在第一天进行预处理,如石蜡切片脱蜡和抗原修复。接着是漂洗,封闭非特异性蛋白间的相互作用,换言之,非特异性染色,随后再一次清洗。然后一抗4°C孵育过夜。

第二天,首先洗去一抗,如果使用过氧化物酶标签,下一个步骤是封闭内源的过氧化物酶。如果使用的是磷酸酶标签,那么要封闭内源的磷酸酶。接下来使用检测系统,孵育一段时间后洗去。若您用的是 ABC 检测系统,那么此时要加入 ABC 复合物。孵育并漂洗,若不是,就跳过这一步。类似地,如果您用的是酶标签,加入色原孵育并漂洗,若不是,也跳过这一步。然后进行复染。如果您用的是酶标签和非醇溶性色原,那么接下来的步骤是脱水、清洗和封片。如果又不是,仍然跳过这一步。最后,无论是哪种情况,都要对染色样品进行封片,便于镜检和保存。

让我们再详细地讨论一下本方案的第一步,该步骤涉及所有必要的样品预处理,如组织切片脱蜡、抗原修复。抗原表位修复的作用是断开醛固定时形成的亚甲基桥,使得抗体接近对固定剂敏感的抗原。因而,只有使用醛固定的样品,或抗原对固定剂敏感,才需要进行抗原修复。所有的样品都固定在包被过的载玻片上,防止样品离解。样本固定在载玻片上的冰冻切片和石蜡切片通常都可以进行抗原修复,除非它们特别易碎,比如脂肪组织。抗原修复有两个常用方法:热诱导抗原修复,简称 HIER,要选择适合的缓冲液,如柠檬酸钠 (pH6) 或 EDTA (pH9)。另一种方法是酶抗原修复,要选择适合的酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶或蛋白酶 K。这两种方法都可与自动化系统兼容,要么作为免疫染色平台的一部分,要么作为一个独立的抗原修复器。如果是手动操作的话,常在压力锅或微波炉里进行热抗原修复,在水浴锅中进行酶抗原修复。

以下抗原修复实验方案是通用的,以使用柠檬酸钠 (pH 6) 进行热抗原修复,使用胰蛋白酶进行酶抗原修复为例。不过,请记住,万能的抗原修复液是不存在的。对每个不同的抗原,必须确定最适合的抗原修复液、酶、pH、修复方法和修复时间。

进行热抗原修复时,先制备柠檬酸钠缓冲液,将 5.88 g 柠檬酸三钠、44 mL 0.2 M 盐酸和 1.956 mL 超纯水混合在一起,调 pH 至 6。然后将足量的缓冲液倒入压力锅中,保证液面比玻片高约 1 厘米。

接下来对压力锅进行加热,不要盖紧锅盖,先让缓冲液沸腾。在等待压力锅煮沸的同时,把石蜡切片放入一个合适的支架,进行脱蜡和复水,换三次二甲苯,每次 3 分钟,然后换三次乙醇,每次 3 分钟,随后用冷自来水冲洗。把切片置于流水下,直至压力锅煮沸。在这个过程中,二甲苯用来脱蜡,乙醇用来除去二甲苯,最后,用水除去乙醇。换言之,切片从有机相转成水相,用乙醇作为中间相,因为有机溶液和水都与乙醇互溶。

一旦缓冲液沸腾,即转移切片到压力锅里,当心热的溶液和蒸汽。然后盖紧锅盖。当压力锅到达满压时,定时 3 分钟。3 分钟过后,断电并将压力锅放入一个空的水槽。

启动泄压阀,同时在锅的上方放自来水,帮助降压。之后,打开锅盖,往锅里放冷自来水 10 分钟,再次提醒,请当心热的溶液和蒸汽。然后就可以进行免疫染色实验方案了。

在这个过程中,我们可以调整所用缓冲液、pH 和抗原修复时间。3 分钟只是一个建议的起始点;少于 3 分钟,可能导致抗原修复不足,多于 3 分钟,可能使得抗原过度修复,造成假染色或背景染色,还可能造成脱片。因此,建议设置抗原修复时间梯度,1、3、5、10 和 20 分钟,进行优化。对于微波炉来说也是一样,务必从缓冲液沸腾时开始计算修复时间。如果你选择使用微波炉,建议采用一台带有测温和搅拌功能的科研级微波炉,以防止修复液剧烈沸腾,导致脱片。最后,也是最重要的一点,对于实验室现有的压力锅或微波炉,请遵照厂家的安全使用说明书进行操作。对于使用的任何化学品,请遵照健康安全手则。

现在我们来看看酶抗原修复方案。先将水浴温度设定到 37 °C。准备两个槽,大小足以容纳玻片架。向其中一个槽中添加足量的超纯水,淹没玻片,然后放入水浴锅,让超纯水升温至 37 °C。将脱蜡和复水后的石蜡切片放入其中保温。

在另一个槽中加入 0.1 g 氯化钙,0.1 g 胰蛋白酶和100 mL 超纯水,使用磁力搅拌器溶解并混匀,调pH 至 7.8,再将此槽放入水浴锅。让酶溶液重新升温至 37 °C。

转移玻片至酶溶液,计时 20 分钟,然后拿出来流水漂洗 3 分钟。接下来就可以进行免疫染色实验方案了。

该方案使用的是胰蛋白酶,但任何酶都是可以用的,只不过要确认相应的Vmax温度和 pH,对于胰蛋白酶,这两个参数分别是 37 °C 和 7.8。在超纯水中预热玻片,可以避免玻片放入时酶溶液降温。建议酶溶液现配现用,否则会影响它的活性。同样地,在放入玻片前,确保酶溶液达到其 Vmax 温度。抗原修复时间少于 20 分钟,可能导致抗原修复不足,多于 20 分钟,则会使抗原过度修复,造成假染色或背景染色,甚至脱片。因此,我再次建议设置抗原修复时间梯度, 5、10、15、20 和 25 分钟,进行优化。最重要的是,对于你使用的任何化学品,请遵守健康安全手则。

现在,我们已完成了实验方案的第一步。第二步,我们要第一次使用含去垢剂的缓冲液进行漂洗。关于缓冲液,常见问题是用什么最好?再次说明一下,没有万能的缓冲液;你得根据你的实验设计,采用一种最合适的缓冲液。对组织切片,我个人会推荐使用含 0.5% Triton X-100 的 TBS,对细胞制片,用含 0.1% Tween 的 PBS,仅供大家参考。TBS 的离子强度比 PBS 高,因此,TBS 有助于降低切片的背景染色,但明显不适用于细胞样本,因为 TBS 可能引起细胞溶解。

去垢剂,即表面活性剂,如 Tween 和 Triton,它们通过去除细胞膜的脂质成分,改善抗体的渗透性,从而进行透化。缓冲液里存在去垢剂,在大多数情况下有利于实验结果。但是,请注意,去垢剂可能会去除一些细胞膜蛋白,我们需要清楚这一点。去垢剂降低表面张力,帮助试剂在样本上铺展,同时,它被认为可以在冰冻切片中分解 Fc 受体,降低背景染色。

Triton 比 Tween 的作用更强,所以 Tween 更适用于细胞样本,因为这些样本具有易碎特性。我发现,对于细胞制片,缓冲液中含有 0.1% Tween,是比较温和的,适用于大多数抗原的透化。

如果需要更强的透化,那么在实验方案的第一步之后,将样本在 4 mM 脱氧胆酸钠中孵育 10 分钟,然后漂洗。也可以直接增大去垢剂浓度,但需注意可能的负面效果,如前所述。附带说一句,如果使用的是磷酸酶标签,那么不要使用 PBS ,因为缓冲液中的磷酸盐对磷酸酶标签有抑制效果。

第一次漂洗后,我们现在进行封闭。封闭液有助于防止不必要的背景染色,这种背景染色会掩盖阳性信号,或者导致假阳性结果。操作步骤如下:在含去垢剂的缓冲液中,加入 10% 正常血清、1% BSA 和 0.3 M 甘氨酸,室温孵育 2 小时。使用的正常血清是二抗宿主来源,这样,样本中可能与二抗有亲和力作用的内源免疫球蛋白会被血清里的免疫球蛋白预先吸附。BSA 有类似用途,它会结合样品中可能与抗体发生非特异性反应的蛋白。醛固定样本中,甘氨酸会与游离的醛基结合,降低疏水性蛋白之间的相互作用。

幻灯片上的图片是一个用错血清的实例。实验采用了二抗抗的物种血清,而不是二抗宿主来源的血清。因此,整个样本呈现出红色荧光二抗发生了非特异性结合。

封闭之后,再漂洗一次,然后进行一抗孵育。抗体稀释液最好使用含有去垢剂和 1% BSA 的缓冲液,孵育时,一抗将会结合其抗原表位。需要确保的是,一抗的种属来源与检测样本的种属来源不能相同,以减少二抗结合内源性免疫球蛋白所带来的背景染色。使用细胞样本时,则不需要考虑这个问题,除非你的细胞是B-细胞谱系,它们不是贴壁细胞。将一抗加到样本上,下一步就是在 4 °C 下孵育过夜。如果抗体的亲和力较低,则还需要延长孵育时间。过度结合并不是问题,因为一旦全部抗原都被抗体结合上,则不会再发生结合反应。低温而长时间的反应有助于减少背景染色,降低蛋白与蛋白的非特异性结合。用一台回旋振荡器轻轻搅动样本,可增强这种效果。过夜孵育通常不是必需的,但具有上述优点。但愿你已经通过优化实验找出了最佳的一抗稀释比例。

做完以上操作,恭喜你!第一天的实验结束了。该回家休息一下,好精神抖擞地应对第二天的实验。一抗已经孵育过夜了,现在我们回到了实验室,进行接下来的免疫染色实验方案。先漂洗玻片一次,去掉一抗,如果我们用的是过氧化物酶标签,那就封闭内源的过氧化物酶。如果不是,那么就略过,直接到下一步。

只有使用辣根过氧化物酶 (HRP) 标签的检测体系需要封闭内源的过氧化酶。血红细胞含有内源性过氧化酶,如果不用过氧化氢封闭,则会与过氧化物酶标签相应的色原发生反应,导致假阳性染色。过氧化氢溶液使用含表面活性剂的缓冲液来配置,石蜡切片建议在 1.6%的过氧化氢溶液中孵育室温30 分钟,如果是细胞样本,则孵育 5 分钟,这样会充分阻断内源性过氧化酶的活性,而不会破坏抗原表位。这就是封闭内源性过氧化酶在一抗孵育后进行的原因,以保证其不会影响实验结果。由于过氧化氢在室温下快速分解为水和氧气,所以必须使用新鲜配置的过氧化氢,以免在封闭时失效。将过氧化氢冷冻并在使用前解冻,这是良好的保存方式。此外,对与内源性过氧化酶含量高的组织(如,脾),最好不使用过氧化物酶标签,而采用碱性磷酸酶 (AP)。内源性磷酸酶的封闭会在后面讨论。

接下来,第四步,使用选定的检测体系来孵育样本。我们来着重介绍三个常用的体系:一、直标一抗;二、生物素化二抗,如亲和素-生物素复合物 (ABC);三、葡聚糖聚合物或紧凑型聚合物标记的二抗。之前的在线讲座中探讨了每一个体系的信号放大和作用原理,包括每种体系的利弊,在这里我不想多谈,但是你可以到 Abcam 博客里查阅。

请注意,如果采用 ABC 体系,那么会增加一个步骤,添加 ABC 复合物,后面我将详细描述。所以,在这个阶段,第四步,所添加的只是生物素化二抗。总的来说,确保每个检测体系的试剂得到最佳稀释比例,并且使用1% BSA的含表面活性剂的缓冲液稀释,样本孵育室温 1 小时。

接下来我们来探讨这个纠结的话题,是用酶标签还是用荧光标签?我们常常遇到这个问题。酶标签常用于组织切片,而荧光标签常用于冰冻组织切片和细胞制片。不过,这并非绝对,应根据免疫染色实验方案选择合适的检测体系。比起酶法,免疫荧光的主要优点是,可以单独观察所有荧光通道,也可以将它们重叠形成伪彩图片。因而,可以很容易的观察信号的共定位,无需专门的软件。同样,如果某个通道信号较弱,也可以单独观察,不受其它通道干扰。

组织切片往往有自发荧光,因为一些组织成分有自然荧光,如胶原蛋白。甲醛固定也会增加自发荧光。如果自发荧光太强,会遮盖阳性信号,使得结果难以解读。因此,对组织切片来说,酶法检测更适合。细胞制片和冰冻切片甲醛固定时间较短,自发荧光较弱。另外,细胞制片往往不含有自发荧光的组分。

现在,将我们的检测体系孵育 1 小时,然后漂洗。如果我们采用 ABC 体系,那么在这个阶段,它将和样本一起孵育。按照厂家说明书来进行操作。ABC 体系的试剂包括单独包装的亲和素,和单独包装的生物素标记复合物。使用时必须将二者按比例混合至少30 分钟形成复合物,然后再将其加到样本中,否则,就不能发挥检测试剂的全部作用。不过,如果你用的不是 ABC 体系,那么略过,直接到下一步。

如果你用的是酶标签,那么现在就可以添加色原了。酶标签接触到相应色原的时候,在一抗结合位点处产生稳定的有色沉淀。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶是最常使用的酶标签。它们都有常用色原, HRP 的色原有 AEC、DAB 和含镍 DAB;AP 的色原有固蓝、固红和新品红。如表中所示,不同的酶和色原组合会在抗体结合位点处产生不同颜色的沉淀物。请注意,有些沉淀物是醇溶性的,这在封片时非常重要,我后面将谈到。

对于所有色原,请务必按照说明书进行配制与孵育。例如DAB ,室温孵育 10 分钟就有不错的效果。务必先确认色原的有效期和存储条件。当DAB 色原存在时,HRP 和过氧化氢形成复合物,HRP 催化分解过氧化氢,生成水和氧气。而DAB提供电子,驱动反应,并且被氧化。被氧化的 DAB 在反应位点形成了黑/棕色沉淀物。过氧化氢在此反应中起了关键作用,由于它在室温下会快速分解为水和氧气,因此,过了有效期的 DAB 试剂盒可能会失效。对实验室任何试剂的贮存、使用、操作和处理,应遵守相应的 COSHH 导则。如果使用碱性磷酸酶标签,则向色原溶液中添加 0.24 mg/mL 的左旋咪唑。左旋咪唑可封闭内源性磷酸酶的活性,减少不必要的背景染色,但胎盘和小肠样本除外。别担心,磷酸酶报告基因标签本身不会受左旋咪唑的影响。

洗去色原并用自来水冲洗后,我们现在可以孵育合适的复染剂了。复染剂通过对某一细胞结构进行染色来增加细胞或组织的颜色对比效果,从而有助于确认免疫染色的位置。复染剂可以是染料或荧光复染剂,在切片体系里起辅助作用,帮助分析一抗信号。对酶检测体系而言,核复染剂是常用的。荧光复染剂我会在这次在线讲座的第二部分讲到。

在酶检测体系中,最常见的核复染剂是苏木精。苏木精有多种配方,不同在于所用的媒染剂类型,以及染色方式是进行性还是退行性。这些不同配方的苏木精将细胞核染成深浅不同的紫色或蓝色。苏木精,具体而言是其氧化产物苏木红,是离子型染料,对 DNA 的亲和力很小。铁盐是媒染剂,与苏木红结合后,形成正电荷染料–媒染剂复合物,能结合离子型染色质。媒染剂是明矾或铝的苏木精可用于进行性染色或退行性染色。

例如,进行性苏木精有 Mayer、Gill 或 Carazzi 等几种,可覆盖在组织或细胞上,直至观察到理想的核染色程度。而退行性苏木精例如 Harris,覆盖在组织上直至过染,然后需要进行分色这一步骤,即将样本浸入酸液,例如1% 酸性乙醇,去除一定比例的过染成分。由于不需要分色,并且不需要考虑酶反应产物是否是醇溶性,例如HRP 与 AEC 的反应产物是否兼容,进行性苏木精比退行性苏木精使用更加简单。

进行性苏木精与退行性苏木精预期的染色均为蓝色。酸性条件下,苏木精染色的细胞核呈红色,但在碱性环境中,苏木精变成令人愉悦的蓝紫色。使用自来水漂洗的目的就在于此,反蓝。自来水通常是碱性,尤其在硬水地区。如果是在软水地区,可使用 0.05% 的氨水进行反蓝。

其它常用的核复染剂有浅绿、固红、甲苯胺蓝和亚甲基蓝;将细胞核分别染成绿色、红色或蓝色。使用核复染剂时有一个重要注意事项,如果抗原是核定位,染色不要太深,因为复染剂的信号有可能掩盖检测体系的阳性信号。

现在我们来讨论一下镜检样本的准备。这非常必要,是为了可以在长期贮存中保护样品,并增强图像质量。通常操作是使用一块盖玻片覆盖样本,并用一种合适的胶黏剂(又称封片剂)将样本固定到位。封片剂可以是水溶性的,适用于荧光标签和酶标签,也可以是有机的,仅适用于酶标签。有机封片剂封片后较硬,使得盖玻片牢牢地保持在原位。

有机封片剂的折光率较好,比如,DPX 在镜下显现出清晰明快的图像。然而,酶标签与底物的反应形成的有色沉淀务必要与有机封片剂兼容。例如,过氧化酶与 AEC 的反应产物是醇溶性的,所以如果用了有机封片剂,信号会在复水和清洗的过程中消失。

荧光标签要求使用水溶性封片剂,可用 10% 甘油,但含有抗荧光淬灭成分的商业化封片剂效果更好。建议在一块空白的盖玻片上滴上封片剂,通过显微镜进行观察,确保它没有自发荧光。很高兴地告诉大家,我们有镜检分析在线讲座,可以帮助大家镜检,分析免疫染色样本。特别是涉及光学显微镜和荧光显微镜的最佳对比度设置,所以在此不做过多讲解。

我们现在来考虑一下多重染色。使用多个标签进行免疫染色的目的,是在同一细胞或组织切片里,同时对两个或多个抗原进行染色定位。各个抗原分别使用不同的标签,以便区分。抗原可以是共定位的,即它们的亚细胞定位一致,或者是分开的。

当两个或多个抗原共定位时,它们的标签会混在一起,产生一种新的颜色。荧光标签和酶标签都可以用与多重染色,但是必须仔细选择,保证它们不会互相干扰,且易于区分。同样地,检测体系的试剂也不能发生交叉反应或互相干扰。这次讲座会侧重于荧光多重染色,后期很可能会有单独的酶多重染色在线讲座。

在继续讲述之前,我们先来看一下荧光的作用原理。荧光分子能吸收特定波长的光,然后发射更长波长的光。在发出荧光之前,荧光分子跟环境相互作用失去能量,从而达到这一目的,这一现象叫内转换。

电子可以是基态或静止态 S0,也可以是较高能量的激发态 S1 和 S2。在每一个电子态,荧光染料存在的振动能级可以有多种,包括 0 级、1 级和 2 级。室温下,能量不足以使电子激发到激发态 S1 和 S2 或基态的较高振动能级。所以,只有当光存在时,吸收才发生在振动能态最低的分子上。

荧光染料在吸收光后,通常被激发至一个较高的振动能级 S1 或 S2,然后再回到S1的最低振动能级,从而完成内转换过程。此过程与光子发射过程结合形成荧光。荧光染料可多次重复这一激发发射循环,直至荧光消失,也就是光漂白。相较而言,有些荧光素更容易发生光漂白。例如,FITC 重复激发发射循环约 30000 次后发生光漂白。而第二代荧光染料,如 Alexa Fluor® 系列的光漂白没有这么快,由于它们有较高的消光系数,比较明亮,更适合用于多标记实验,如本幻灯片图像所示。

带着这些认识,我们接下来探讨,怎样选择多重染色实验中的荧光标签组合。如果没有合适的光谱分析软件,那么就必须选择发射光谱不重叠的荧光染料。这很关键,否则,一个荧光素的发射信号可能会被为另一个通道检测到。这个现象叫串色或交叉。串色的发生是由于荧光素非对称光谱的特性,并与带宽较宽有关。

请看右下图对 Alexa Fluor® 488 和 Alexa Fluor® 555 的发射光谱分析。它们的最大发射峰看上去是分开的,但实际上有明显的重叠。使得Alexa Fluor® 488 的信号会串色到 Alexa Fluor® 555 的通道中。右上图可见同样的现象,Cy3® 串色到 Texas Red® 通道中。

所以,我们可以选择一个发射波长更长的荧光素,最大限度的减小发射峰的重叠。如果用 Alexa Fluor® 594 来代替 Alexa Fluor® 555,则Alexa Fluor® 488 的串色会足够小,使得多重染色实验可以一起使用这两种染料。因为跟 Alexa Fluor® 555 相比,Alexa Fluor® 594 的发射光谱位于 Alexa Fluor® 488 发射光谱右侧更远的地方,重叠较小。

这就是为什么在三色或四色荧光染色时,经常选择不同光谱区域的染料。由于吸收光谱和发射光谱都分隔得足够远,串色很小甚至没有。例如,常用到的一种传统染料的组合是:DAPI 蓝色染料、FITC 绿色染料、TRITC 黄色染料和 Cy5® 红色染料。而相应的第二代染料组合是:DAPI 蓝色染料、Alexa Fluor® 488 绿色染料、Alexa Fluor® 555 黄色染料和 Alexa Fluor® 647 红色染料。

值得一提的是,并非每一个荧光信号都必须来自于偶联荧光素的抗体。荧光信号可来自核复染剂,如 DAPI,来自细胞器特异性染料,如 MitoTracker,也可来自细胞膜染料,如荧光素偶联的小麦胚芽凝集素。仔细选择相应吸收波长与发射波长的显微镜滤光片可大大减少串色现象。事实上,最终决定能否使用某一荧光素的是滤光片组。

设计荧光多重标记实验时,可以采取以下几个步骤,以最大限度的减小或消除串色现象。首先,分析待选荧光素的吸收光谱和发射光谱,结合显微镜滤光片组的特点,评估是否兼容。尽量选择发射带宽窄的荧光素,以最大限度的减小与其它荧光素光谱的重叠。使用最明亮的荧光素来标记表达丰度最低的蛋白。如果蛋白的丰度相近,则适当降低波长最短的荧光素的使用浓度,从而减小到较长波长荧光素的串色程度。仔细选择显微镜的滤光片组,尽可能的匹配每种荧光素的吸收光谱和发射光谱。

调整显微镜的曝光,增益与减光镜设置,微调过强的荧光信号。最后,在多重染色之前,分别进行单染预实验,使用其它滤光片来观察评估串色问题。并根据上述参数调整实验设计。

虽然这次讲座的重点不是多重酶标签染色,但我想简单比较一下酶法标记和荧光标记。之前已经讨论过,免疫荧光有多种可供选择的荧光素标签,具有极高的灵敏度,并且容易单独地观察每个标签。不过,比起酶法,免疫荧光有几点不足。首先,当荧光染料互相靠近时,信号可能猝灭。因为能量从一个激发的荧光染料转移到了另一个荧光染料,称为共振能量转移。其次,在贮存或镜检过程中,会发生荧光信号的衰减或光漂白。最后,醛固定会增加样本的自发荧光,有可能干扰实验结果的分析。

酶和色原的组合,会产生两种或多种有色沉淀,解决荧光法的这些问题。有色沉淀是定位在组织上,独立于一抗与检测系统,哪怕几轮的免疫染色,都不用担心出现交叉反应。对于荧光和酶色原产物, 解谱软件可以分离并单独观察信号,哪怕是肉眼都无法识别的共定位,因此我们可以使用多种不同的标签。

现在让我们来讨论多重染色技术。简言之,多重染色实验是同时使用两个或多个标签的染色技术。多重染色方案以本次讲座前半部分为基础,必要时加上孵育和清洗步骤。无论何种情况,都强烈推荐使用预吸附的二抗,有助于尽可能的减少交叉反应。在多重标记实验中,强烈建议先单独优化每种单标记的实验条件,然后才将它们组合起来。主要关注点是怎样避免每一检测体系的单个成分之间发生交叉反应。

多重染色技术可分为两种方法:同步法,一抗同时孵育;逐步法,一个单标记染色技术做完后再做另一个。

首先我们来看同步染色。如果一抗来源的种属之间差异足够大,那么它们可以同时孵育。小鼠来源和兔来源的一抗组合,差异足够大,而小鼠来源和大鼠来源的一抗组合则不然。其次,如果二抗的种属来源相同,可以同时孵育。如果抗体是直标一抗,即一抗上直接偶联不同的标记物,那么哪怕抗体的宿主来源相近甚至相同,也可以做到同步染色。当然,前提是抗原的表达丰度高,要求的信号放大程度低。如果抗体来源于同一物种,但是同种型不同,那么使用针对相应同种型的二抗,也可以进行同步染色。大家可以看出,在同步染色中,我们能做的很有限,尤其是在信号放大方面,相较而言,这方面逐步染色更有优势。

比起同步染色,逐步染色灵活得多,对于低丰度的抗原,可以进行额外的信号放大,而不仅仅是使用二抗。对于丰度最低的抗原,应使用最灵敏的检测体系。需特别注意试剂的添加顺序。举个例子,三个均源于小鼠的一抗:一个是荧光素直标一抗,一个生物素直标一抗,一个是非直标一抗。

第一步:将样本与非直标小鼠一抗一起孵育。

第二步:将样本与荧光素标记二抗一起孵育,如山羊抗小鼠二抗。

第三步,将样本与小鼠血清一起孵育,确保山羊抗小鼠二抗被封闭。

第四步:将样本与生物素化小鼠一抗一起孵育。

第五步:将样本与荧光素偶联 ABC 复合物一起孵育。

最后第六步:将样本与荧光素直标小鼠抗体一起孵育。

这就是三重染色,而试剂之间不会发生交叉反应。还请注意,以上的每一步骤之间,需要用缓冲液漂洗。

使用同一种属来源的抗体时,另一个方法是增加桥接抗体。举个例子,两个小鼠来源的一抗:一个非直标抗体,另一个是HRP 直标一抗。

第一步:将样本与非直标一抗一起孵育。

第二步:将样本与荧光素标记二抗一起孵育,如山羊抗小鼠二抗。

第三步,将样本与小鼠血清一起孵育,确保山羊抗小鼠二抗被封闭。

第四步:将样本与 HRP 直标一抗一起孵育。

第五步:将样本与抗 HRP 的抗体(如兔抗)一起孵育。

最后第六步:将样本与荧光素偶联山羊抗兔抗体一起孵育。

第二种也可以换用生物素化的抗体和 ABC 体系。同样,还请注意,以上各步骤之间,需用缓冲液漂洗。

最后,让我们考虑一下多重免疫染色时必须使用的对照组。对照组是非常必要的,用于验证染色结果是否真实,而不是根据检测体系或样本特性。由于多重染色是两个或多个单标记染色技术的组合,每一检测体系所需的试剂对照数量相当庞大。考虑到时间限制,至少要完成以下对照组。首先是阳性对照,针对各个一抗。然后是阴性对照,针对每一检测体系,分别实施无一抗对照。

我的讲座差不多该结束了,但是关于多重染色,如果别的都忘了,那么请记住以下内容。只要在实验设计上多花功夫,可用的染色组合非常多。选择发射光谱不重叠的荧光素,并匹配显微镜的滤光片。认真考虑各种可供选择的检测体系、潜在的交叉反应以及试剂添加顺序。最后,一定使用适当的对照,并单独对每一个染色进行预实验,以便优化各个试剂的浓度并评估可能的串色。

非常感谢你们的参与,我希望你们都觉得有用。现在暂时把时间交给 Judith。

J:谢谢 Simon 讲得这么详细,大家好。借此机会给大家讲讲 Abcam 的 IHC/ICC 产品与解决方案,帮助大家改进细胞成像实验。兔单抗 RabMAb 拥有高亲和力和高特异性,染色的灵敏度高且背景低。这使得它们特别适用于要求严苛的应用,如福尔马林固定石蜡包埋组织的 IHC 分析。RabMAb 经过组织芯片 IHC 检测或多样本 ICC/IF 检测,可提供最佳结果。RabMAb 还提供人和小鼠蛋白靶标的多种表位识别,所以无需额外替代抗体。鉴于 RabMAb 是兔抗,特别适用于小鼠或大鼠组织样本。RabMAb 也适合与小鼠或大鼠单抗配对,进行同步染色。想了解更多信息,请访问 abcam.com/RabMAbs。

对于 RabMAb 染色,我们推荐最新推出的 Alexa Fluor® 偶联二抗。这些二抗偶联了 Alexa Fluor® 488、555、594 和 647。Alexa Fluor® 偶联二抗在 Abcam 实验室经过广泛测试,确保明亮的染色和较低的背景。预吸附抗体的选择范围较大,可以保证那些抗体之间没有交叉反应。所有产品的稀释度介于 1/200 和 1/1000 之间,可进行约 250 次染色,性价比很高。想了解更多信息,请访问 abcam.com/Alexa。

Abcam 的产品目录包括一系列细胞成像工具,可用于多重染色。我们的 CytoPainter 系列试剂盒,可用于肌动蛋白丝、线粒体和溶酶体的多重染色。它是一个简易的共定位研究方法,不必在多个抗体上浪费时间。CytoPainter 试剂盒可以跟二抗和核染料组合使用。举个例子,请看右上角所示的小鼠胚状体的 IHC 图像。

想得到出色的核染色,何不试一下远红外染料?染色不到五分钟即可。本系列有 DRAQ5 和 DRAQ7,可用于活细胞或固定后细胞的染色。下图中,细胞核是用 DRAQ7 染的,蓝色源于 AMCA 偶联二抗。

针对细胞成像,我们有广泛的二抗产品组合已经过验证,包括Alexa Fluor ®偶联二抗和预吸附二抗,最小化交叉反应。我们还有用于光谱显微镜的 Chromeo 偶联二抗、用于高分辨率电子显微镜的 AbGold 偶联二抗。为了增大 IHC 实验中的组织渗透度,我们建议您试用F(ab’)2 系列抗体。

对于酶法检测,Abcam 也有全面的 IHC 产品系列。产品组合包括 EXPOSE IHC 试剂盒,其灵敏度大于聚合物检测体系和 ABC 检测体系。这是通过一种较小的检测复合物实现的。除了各种试剂以外,我们的 IHC 产品组合还包括经典的生物素和链霉亲和素试剂盒。关于我们的细胞成像产品,如果你想知道更多详情,请访问 abcam.com/Imaging。这个页面上,你可以找到更多详尽信息,还可以放大查看图像。

使用小鼠抗体检测小鼠组织的时候,常遇到问题,背景水平高。这是因为二抗结合了内源性小鼠 IgG。我们提供的小鼠对小鼠 IHC 检测试剂盒就能解决这个问题。这种聚合物型检测试剂盒含有一种封闭剂,可封闭内源性小鼠 IgG,保证背景尽可能低,并使检测方案简单可靠。该产品的更多信息可见 abcam.com/MoM。

Simon 在讲座中有提到,防止光漂白极其重要。为此,Abcam 提供一系列荧光封片剂,包括含或不含 DAPI 和PI等核染料。Abcam 技术支持团队会尽力回答您提出的任何问题。团队成员擅长多种语言,可提供法语、西班牙语、德语、中文和日语等多语种支持。您可以在美国、英国、香港和日本联系他们。

在Abcam网站上,你可以找到各种各样的免费资源和实验方案。您可能感兴趣的是新的IHC应用,以及“了解二级抗体”指南。后者解释了在多重染色实验中何时使用F (ab’)2片段和预吸附二抗。

同时,我想强调一下我们未来的网络研讨会。如果您能在3月21日参加我们的高级免疫沉淀在线研讨会,我们将非常高兴。来自Abcam的Sean Garry博士和Rachel Imoberdorf博士将出席这次网络研讨会。它提供了许多实际的建议和难题排除技巧,以改进您的IP实验。对于我们说西班牙语的听众,我们在4月10日提供了一个西方Blotting介绍网络研讨会。你也可以听我们过去所有的网络研讨会,包括Simon最近关于设计IHC/ICC实验的网络研讨会,只要去abcam.com/Webinars就可以了。

为了感谢您参加这次网络研讨会,我们想给您一个特别的折扣,包括所有的二级抗体,细胞导入剂,IHC试剂盒,avidin和streptavidin,和RabMAbs。您所要做的就是在您下订单时引用ICCTBDYY的促销代码。最后,我要感谢Simon和你们所有人的参与,并祝愿你们在未来的IHC-ICC实验中一切顺利。

SR:    谢谢你, Judith. 和第一次网络研讨会一样,我们遇到了一些非常好的问题。由于时间有限,我只能浏览其中的三个,所以我挑选了三个非常好的。凯文问过我:我在多标签实验中有很高的背景。为什么会这样呢?好吧,这可能是由于很多原因,凯文,例如过度检索抗原,可能尝试更少的可检索时间,不同的缓冲,更多的酶。封闭不够,封闭时间太短,或者使用了错误的血清。你的组织也可能含有丰富的内源性酶,或者它们没有被充分冷却。如果使用ABC检测系统,组织也可能富含内源性生物素。还有什么?物种间的交叉反应,所以检测试剂可以是交叉反应,或者二级反应可以简单地与阻断血清中的免疫球蛋白结合。也许你想尝试使用预吸附二抗来增加特异性。但你使用的抗体可能不适合免疫组化,或者也可能是非特异性的,在你的样本中也可能有高水平的自身荧光。我不知道你的实验设计是否准确。

还有很多其他的可能性,真的,现在还不能说,但是如果我是你,我会逐行见检查你的实验方案,看看你能不能找出上面的任何一种可能性。不要忘记为每个正在使用的单染色过程包括所有必要的控制,并单独执行它们的全部。这很可能是你的背景染色来源的关键所在。无论如何,祝你好运!

另一个问题. Mandy 说:我用驴血清做阻断和抗羊二级,我的背景真的很高,你有什么建议?我想到的最明显的事情是即使你的二抗是针对羊免疫球蛋白的,它也在一定程度上检测驴。这都与这个有关,与系统发育有关,所以驴和羊都是有蹄类——如果我说错了请纠正我——因此,免疫分析序列和免疫球蛋白重链将非常相似,因此,交叉反应的可能性。

我想你可以做几件事。第一,你可以使用一种已经预吸附在驴身上的抗羊抗体,看看效果如何。或者你根本不能使用驴血清来封闭,完全忽略它,看看问题是否停止。或者,我猜,你也可以看到你是否能找到一种针对你的抗原的不是在羊体内提取得到的初级抗体;如果你用不同源的二抗,例如,试着找到老鼠或兔子的一抗,并使用山羊中得到的二抗。试一试,看看是否有帮助。

我们还有时间再讲一个,最后一个来自Steven,他想知道:你提到了光谱或混合软件,你能告诉我们更多吗?我要完全诚实地说,Steven,我自己并没有多少实际使用它的经验,但我参加过几次讲座,那里的人们对它印象深刻,并展示了一些他们在实践中取得的良好成果。相信我,如果我能控制部门的预算,我明天就会买一个。简而言之,显微镜软件比人眼对颜色更敏感。换句话说,它可以区分标签中非常细微的颜色差异,特别是当它们被合并到共同定位实验中时,更容易地分离和显示信号。因此,让我们使用报告标签光谱重叠的显色和最终产品,和荧光标签,允许在多标签实验中使用额外的标签,否则你将无法区分人眼。如果你有多余的钱,花这些钱是值得的。就像我说的,由于时间的限制,它们是我能回答的唯一的问题,但是非常棒的问题。非常感谢。Lucy,你来收拾东西。

谢谢Simon和Judith。正如Simon提到的,我们没有时间回答所有问题,但是对于那些没有被回答的问题,我们的科学支持团队将很快与您联系,并给出答复。同时,我们也收到了一些关于人们在哪里可以找到演示幻灯片副本的问题。当你从网络研讨会退出时,你会被重定向到一个可以下载PDF文件的网页,你也可以找到更多关于网络研讨会推广的信息。如果你对我们在这次网络研讨会上讨论的内容有任何疑问或有任何技术上的疑问,请不要犹豫联系我们的科学支持团队,他们将非常乐意帮助你。可以通过technical@abcam.com联系他们。最后,我们希望你喜欢这个网络研讨会,并发现它对你的工作有用,我们希望欢迎你在未来参加另一个网络研讨会。再次感谢您的参与,祝您研究顺利。

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