All tags western-blot 荧光蛋白质印迹(WB)在线研讨会

荧光蛋白质印迹(WB)在线研讨会

观看由伦敦国王学院(KCL)的Martin Broadstock博士演讲的在线点播研讨会

学习这项非常常见而又强大的用于低丰度蛋白及蛋白表达变化准确检测的技术。

此在线研讨会是提供给那些想学习荧光WB或想要把灵敏的荧光检测法加入常规WB实验方案的科学家。

​​​​

在线讲座主题:

  • 荧光WB介绍
  • 荧光WB研究中的应用
  • 荧光WB的用法
  • 荧光检测的用法
  • 荧光法对比化学发光法的优势
  • 荧光法使用中的挑战及常见误区
  • 荧光WB的未来趋势


关于演讲者:

Martin Broadstock博士目前为伦敦国王学院爱德蒙和莉丽‧萨夫拉研究中心的研究员​。

他在生物医学领域工作有十年,他的研究课题为治疗帕金森病的新疗法。


研讨会内容:

​​大家好,欢迎参加 Abcam 的“荧光蛋白印迹”在线讲座。今天的演讲嘉宾是来自伦敦国王学院的 Martin BroadstockMartin 在过去十年从事生物医学研究工作,是国王学院爱德蒙和莉丽萨夫拉研究中心的研究员。在那里,他研究了治疗帕金森病痴呆症的新疗法。 

事实上,我的研究重点是多种神经退行性疾病中的突触功能障碍,并研究治疗方法及其对这些功能障碍的潜在影响。在技术上,我经常进行蛋白印迹,现在所有蛋白印迹都采用荧光显示。我现在做的大多数免疫组织化学和免疫细胞化学也是用荧光显示。我也做一些体内研究,但今天将不会涉及到这部分内容。所以我想强调的是,在沃尔夫森中心,实际上我们已经不再需要在暗室中进行操作,而是享受荧光蛋白印迹的乐趣。就像示例图一样 — 右边是一个示例图像,我们已经将其转换为便于发表的灰度结果。这是多通道蛋白印迹,通过同一张凝胶,使用不同抗体(大部分来自 Abcam)得到两张图像,结果表明,对阿尔茨海默症小鼠模型实施助氧化剂饮食治疗后,突触蛋白表达发生改变。 

那么现在我们来谈谈荧光蛋白质印迹,与大家所熟知的 ECL 蛋白质印迹进行比较。在进行蛋白印迹的开始阶段,ECL 和荧光法并没有太大的区别。

通常情况下,首先从组织或细胞中提取蛋白质,定量蛋白质总量,这些我在此没有显示。一旦稀释好了所有的样品或校准样本单位体积的浓度相同,或者确定了凝胶的上样体积,就可以上样并跑凝胶电泳。

然后,将凝胶转移到膜上,通常是 PVDF 膜或硝酸纤维素膜,封闭非特异性结合后,与所选一抗一起孵育。一段时间后,将其与二抗进行孵育,在这个步骤,两种不同的检测方法才开始有区别。如果使用辣根过氧化物酶偶联抗体和 ECL检测体系,就必须配备 ECL 检测试剂,再通过曝光获得胶片,并分析所得图像,希望您获得如左上角所示的清晰图像。

然而,如果使用荧光蛋白印迹法,抗体染色后可直接进行图像分析。可以看到,这一定程度上简化了工作流程,让你能真正着手于实验室的其他工作。 

使用荧光蛋白印迹有什么优势?其一是,与 HRP ECL 相比,信号得到改善。对于 ECL,一旦将所有试剂混合后转移到膜上,信号稳定的时间通常为半小时。而对于荧光法,信号更加稳定,事实上,一些膜在一年后重新扫描,其定量分析结果与一年前相同。实验室正在进展中的项目的膜可以保存,以后可能需要进行独立验证。有时候,ECL 会导致较小分子量的蛋白变得模糊,而通过荧光法,这些小分子量蛋白质显现得更为准确清晰。此外,荧光法通常显示出较高的灵敏度,因此与 ECL 相比,能够检测出更微量的蛋白质。除了灵敏度问题,荧光法的低成本在如今的经费环境下显得尤为重要。 

虽然一些扫描仪的初始投资确实相当昂贵,但如果您的部门经常进行相当数量的蛋白印迹,那么转换为荧光检测可能更划算。这样,就不需要胶片和显影剂,胶片和显影剂本身并不便宜,而且显影剂通常有毒。也不需要在黑暗的房间进行操作,因为现在大多数扫描仪都是台式机,并且可以轻松地放进实验室。另一个节省的关键是抗体的成本,我通常约 1/10,000 1/20,000 倍稀释二抗,这意味着一点点抗体就可以用很长时间,并且这些抗体的成本通常与 HRP 偶联抗体的成本相同。另外,基于印迹的方法可进一步节约成本,因为可以减少分子量标记物,许多分子量标记物即使没有作为适用于荧光检测进行销售,一旦进行扫描,同样会出现荧光。事实上,LI-COR 网站指出,荧光蛋白印迹的单次成本为 1.84 美元,不包括去标记 (stripping) 和重新标记 (reprobing) ECL 印迹的单次成本为 18.39 美元,包括去标记的 ECL 印迹的单次成本为 27.42 美元。因此,如果使用荧光,每次印迹可以节约大致 20 美元或15 英镑。因此可以看到,如果一天做 100 次凝胶,可以快速地节约大量成本。  

除了增强灵敏度和降低成本之外,另一个主要优点是多重测定功能,可以在单个膜上同时检测两种蛋白质。例如,您可能需要研究磷酸化蛋白质,并将其表达水平与未磷酸化的对应靶点进行比较。虽然,使用旧的系统,您可以跑两块 ECL 凝胶,并对不同的亚型进行去标记和重新标记。如果使用荧光法,可以在一块凝胶上使用两种不同的一抗与两种荧光二抗。这样就没有去标记和重新标记相关的问题,并且样品跑胶的方式和转移效率也完全相同。我们经常将目标蛋白和内参蛋白一起进行检测,对于我自己来说,可能是 β- III 微管蛋白或肌动蛋白,这样可以在相同凝胶上精确地进行蛋白标准化。如果蛋白质的分子量接近,去标记和重新标记就可能非常棘手,如果进行过于强烈的去标记操作,那么蛋白质就有可能从膜上剥离下来。最后一个优点是节约时间,我前面也提到过,这意味着你可以着手于其他要紧的任务。 

因此,我可能要开始说服你进行荧光检测了,但是从 ECL 转换到荧光法的最好方法是什么呢?在接下来的两张幻灯片中,我总结了在我们首次进行转换时遇到的不同问题的一些想法。您可能遇到的第一个问题是一抗的使用浓度。一般来说,根据我的经验,可能需要减少一抗用量,因为过多的染色可能会使得扫描系统过爆,这可能导致检测的准确度降低。所以,需要优化抗体浓度,有时候一抗浓度恰当,我们需要调整二抗,选择能够产生漂亮、清晰信噪比的稀释条件。说实话,这可能是进行转换时最重要的问题,只需要做一点重新优化,一般来说,我建议使用低一点的浓度。 

另外一点,使用自发荧光低的膜,这点非常重要,否则在检测信噪比和条带定量方面将会遇到困难。实际上,现在许多供应商都宣称他们的膜具有低自发荧光,可以在市面上买到低荧光的 PVDF 膜。然后关注一下使用的封闭缓冲液,跟 ECL 一样,不同的封闭缓冲液会产生不同的影响,尤其是针对一抗。我通常使用含有 5% 脱脂牛奶的 PBS Tween 溶液。 

在缓冲液的问题上,确保您选择的缓冲液完全溶解,溶液中没有一点颗粒。如果有的话,这些颗粒可以沉积在膜上并产生荧光伪影。此外,有趣的是,圆珠笔标记具有一些自发荧光的能力,这种情况可能会发生,并导致信号弥散。所以,如果现在你在使用圆珠笔,可以用铅笔代替。不要太用力压膜,因为锋利的物体有时同样会留下荧光伪影。所以尝试用钝头镊子处理它们。  

特别是,就荧光而言,使用的大多数一抗耐光能力较强,并且在正常的实验室照明下不会褪色。但是,我必须承认,我倾向于在黑暗中孵育膜,因为旧习难改。而且,我总是用锡箔纸包裹抗体储存液,并将它们放在不透光的盒子里,消除一切光漂白的可能性。 

当处理膜时,始终要用无粉手套,否则最终会得到一张满是荧光指纹的杂乱的膜;所以不难发现谁是罪魁祸首!

老实说,我尽量避免在荧光膜上进行去标记和重新标记操作。通过多重检测,我已经使用内参对照来反映总蛋白。我发现,在不影响膜的其它区域蛋白的情况下,移除抗高丰度蛋白的抗体非常困难。而对于低丰度的蛋白就可以,网上可以搜到许多配方,诸多供应商也提供了专有解决方案。就像我说的,我们之前检测低丰度蛋白这样做过。  

最后,如果上样染料中要使用溴酚蓝,我建议确保染料前沿移动到离预期蛋白质足够远的位置,因为这种染料具有产生荧光的倾向。话虽如此,对所有样品我每次都使用溴酚蓝,但是我发现通过改变凝胶百分比,可以确保染料前沿已经跑过了我的目标区域。 

所以现在我要谈及多重检测,这里有几个要点可以帮助您充分利用这一令人兴奋的优势。听起来很明显,但值得指出的是,若想进行多重检测,则需要使用从不同物种产生的一抗。同样值得考虑的是,您可能希望使用来源于亲缘关系较远的物种的一抗,因为种属关系接近的抗体,如小鼠和大鼠,很可能发生交叉反应。我建议使用高度交叉吸附的二抗,这样可以防止通道相互渗漏。使用不同、非重叠光谱的荧光染料。作为一般的经验法则,在将抗体用于多重检测之前,我也会单独优化每一个抗体。这样可以验证两种抗体,当尝试进行多重检测并观察特异性信号时,有时抗体会出现次要、非特异信号。可能是因为特异性信号被另一个抗体的非特异性信号所掩盖。 

所以能够进行多重检测是蛋白质印迹非常有价值的进步,但是荧光蛋白质印迹的未来如何?在某种意义上,这些技术如今已被广泛普及使用,因为没有任何手段可以预测其未来的发展,我想我只会简单的提及这些技术,因为跟目前使用的方法相比,它们有一些具体的优势。原位凝胶蛋白印迹正如其描述那样:将完全省略转移至硝酸纤维素膜的步骤,而直接用抗体染色凝胶。该方法非常适用于大分子量蛋白(通常难以有效转移),同时不会丢失同一块凝胶上的小分子量蛋白。您可以省略封闭步骤,并直接将一抗和二抗孵育于凝胶上。就像我说的那样,许多人反馈其灵敏度很高,特别是对那些难以转移的蛋白质。然而,直接处理凝胶可能有点麻烦,并且处理凝胶时可发生破裂,通常根据我的经验,取胶要非常小心。 

另一种选择是完全抛弃基于凝胶的系统,这可以通过使用细胞表面或细胞内蛋白印迹来实现。根据蛋白质位置,确定是在细胞表面还是在细胞内。在方法上,这与免疫细胞化学最相似,固定细胞、通透或不通透处理细胞膜,如果研究的是膜结合蛋白质,加入一抗,然后加入后续二抗。我通常与肌动蛋白联合来对照不同孔之间的细胞数量差异。这种方法使得分析稍微复杂一点,但是省略了蛋白收集、跑胶步骤,该过程本身节省了大量的时间,弥补的时间远超于此。这种方法具有高灵敏度,也可用于验证 RNAi 干扰。基本上,如果您的抗体可用于免疫染色和蛋白印迹,那么就可能同样适用于细胞表面或细胞内蛋白印迹。  

为了使荧光读数可见,当然需要一个成像系统,这个成像系统可能已经在你的部门用于不同的应用。有两种主要的系统类型:红外系统和非红外系统,IR 系统是我最熟悉的系统,这就是 LI-COR Odyssey 系统。这个系统使用 700 nm 800 nm 两个激光器来激发红外范围内的荧光染料,就是得益于红外检测范围,LI-COR 自发荧光非常低。这个系统的缺点是,通常不能将二抗用于其他应用,因为大多数显微镜在红外范围内不能成像;但是原位凝胶和细胞内蛋白印迹都可以。 

或者,您可以使用一种非红外系统,许多供应商都推出了各种各样的系统。随着成像系统到位,我想我会简要回顾一下荧光蛋白印迹的四种最常见的问题和可能的解决方案,即:整体高背景、斑点背景、弱信号和非特异性条带。 

其中一些问题对于 ECL 或其他检测系统来说是一样的,那么这种解决方案可以视为优化蛋白印迹的通用方法。 

所以在这里,我整理出了一些可能导致高背景的原因,以及一些有助于消除这些原因的可尝试的技术小窍门。高背景往往是由于封闭不彻底造成的,所以我建议这是首要检查的部分。尝试使用另一种封闭溶液,BSA 或牛奶。尝试添加一些去垢剂(如 Tween 20 SDS),以除去附着在膜上的多余的蛋白质。优化抗体浓度,重要的是保持膜均匀湿润,尽可能少地触碰它。  

另一个问题可能是背景中出现斑点,而不是背景荧光的整体增强。同样地,保持膜均匀润湿、清洁扫描仪并过滤所有使用的封闭溶液,有助于控制这个问题。 

蛋白印迹中经常遇到信号弱的问题,在尝试我建议的任何其他步骤之前,我建议首先增加凝胶上的蛋白质总上样量,然后调整一抗浓度。此外,您可以尝试调整二抗浓度,我始终建议您在转膜后进行一次染色,例如进行丽春红染色来检查转膜效率,以及膜上出现的气泡问题。如果转膜没问题,您可能需要重新检查膜,尤其是一些较小的蛋白质可能已经穿过了膜,而较大的蛋白质才开始迁移。在这种情况下,我建议要么减少转膜时间,要么尝试更小孔径的膜。 

我想要解决的最后一个问题是非特异性条带。如果单独研究每一种抗体,这种情况的罪魁祸首通常是一抗浓度过高,或孵育时间太长。尝试降低一抗浓度或缩短孵育时间,如果您在室温下进行,可尝试在 4 °C 过夜孵育,我发现 4 °C 过夜孵育是最佳条件。进行多重检测时,使用来自不同物种的抗体,优选亲缘关系较远的物种。检查不同抗体的光谱确保没有串色,如果这样没有改善,可以尝试减少凝胶上的蛋白质总上样量,以减少信号,同时保持特异性。现在我把时间交给 Gus 

AM:谢谢Martin非常有趣和翔实的介绍,以及非常有价值的荧光蛋白印迹疑难解答。现在,我要向大家介绍对荧光蛋白印迹实验有用的实验方案和资源。 

首先我要强烈推荐来自 Abcam 的可用于荧光蛋白印迹的大量经过充分的验证二抗产品,包括最大限度减少物种交叉反应的 FITCDyLight CyDye 预吸附二抗。

我们很高兴地宣布,目前还提供 AlexaFluor®488555594 647 偶联二抗。 

为什么要选择 AlexaFluor® 偶联二抗?我们所有的 Alexa 二抗都在内部进行了广泛的测试,保证了明亮的染色和低背景。作为 QC 过程的一部分,我们将二抗对照品以 1/200 的比例稀释,以确保二抗的特异性。此外,预吸附二抗的选择范围广,以确保低物种交叉反应和抗原免疫球蛋白的识别。如果您想同时使用这些产品做 ICC,假设以 1/200 进行稀释,可进行至少 250 次实验。通过所显示的链接了解更多信息。 

我们的目录还包括用于直接荧光检测的大量抗体和蛋白质。示例显示了用于荧光蛋白印迹的 β 微管蛋白抗体的五星评论。如图所示,可以使用我们的高级搜索工具,搜索荧光直标一抗或纯化蛋白检测,并在 Abcam 网站左侧选择所需的偶联物。 

为使您更方便地转换至荧光蛋白印迹,我强烈向您推荐 Optiblot 荧光蛋白印迹试剂盒。该试剂盒允许在一个印迹上对两种蛋白质进行荧光检测,而不需要去标记和重新标记。该试剂盒包含了进行荧光蛋白印迹所需的所有试剂。试剂盒包括低荧光背景的 PVDF 膜、优化的缓冲液和两种荧光标记的二抗。试剂盒提供的二抗比 Cy 染料更明亮,可以在 Cy3 绿色通道和 Cy5 红色通道进行观察。该试剂盒与许多非红外线荧光检测系统兼容,Martin 在刚才的讲座中也提到了一些。 

如果转换为荧光蛋白印迹对于您仍是一个挑战,那么您可以试一试一系列高灵敏度 Optiblot ECL 底物,该试剂会让您享受到荧光检测的诸多优点。除了化学发光之外,这些底物同样有荧光,可以提高灵敏度并维持信号。使用蓝色 488 nm 激光器激发底物,并且可以使用与 Cy3 染料发射相兼容的橙色滤光片进行检测。Optiblot 系列的 ECL 试剂盒还提供了一系列其他功能,可以提高蛋白印迹实验方案的灵敏度和灵活性。 

Optiblot 系列产品除了提供用于荧光检测的试剂之外,还提供能够增强蛋白印记实验结果和简化实验方案的大量产品。包括具有两年保质期的 Alexa 荧光凝胶,以及用于简化上样步骤的染色孔。还提供其他一系列缓冲液和搭配工具,包括可在短短 15 分钟内提供凝胶染色的 Optiblot 蓝,即考马斯染色),以及蛋白质梯状条带和低荧光背景的 PVDF 膜。 

此外,您可以在 Abcam 网站上找到各种资源,可帮助您解决荧光蛋白印迹相关疑难问题或荧光蛋白印迹体系设置方法。请访问显示的链接,查找更多信息。还有蛋白印迹疑难解答提示手册,您可以下载作为实验的有效工具,或者您可以通过发送电子邮件给我们的客户服务团队,索取个人副本。 

最后感谢您参加本次的在线讲座。下面,我们开始回答一些问题。提一下,为了感谢您参加本次在线讲座,本次讲座涉及的产品均提供 25% 的促销折扣。有关此优惠的更多信息将在讲座结束之后发送给您。

Molly问到:如果需要储存荧光蛋白印迹膜用于将来成像,有何建议?

保持膜湿润,保持黑暗,用保鲜膜包裹并保持湿润,我还把膜放到锡箔纸中,然后将它们置于冷室。 

Rahila 问到:如果我们转换为荧光蛋白印迹,则必须使用荧光抗体,但是可以使用这些荧光抗体进行常规免疫细胞化学分析吗?

老实说,Rahila,这取决于你要使用的检测系统。使用 LI-COR 系统就无法用于常规免疫细胞化学分析,但其他任何系统就可以。 

Nadine 问到:荧光蛋白印迹的灵敏度是多少,皮克 (pg) 还是飞克 (fg)

当然是皮克,但是,这又取决于你要使用的检测系统。 

谢谢你们。已经到了本次讲座的尾声了。对于问题尚未得到回复的听众,我们将尽快与您联络并进行解答。同样,要告诉您的是,本次讲座的 PDF 副本可供下载。当您退出本次在线讲座时,会自动跳转至一个网页,在该网页上可以找到下载版本,以及进行中的在线讲座相关的特别促销信息。如果您对荧光蛋白印迹有任何疑问,或者您需要科学咨询,请不妨联系我们的技术支持团队,他们会非常原意帮助您。他们的联系邮箱是cn.technical@abcam.com。希望您通过本次在线讲座收获到有用的信息,欢迎您以后参加其他的在线讲座。感谢您的参与,祝您研究顺利。 


注册