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进阶免疫沉淀技术网络研讨会

相互作用还是没有相互作用?免疫沉淀来告诉您!

由于蛋白质相互作用的复杂性,确定真正的蛋白质相互作用可能是一项困难的任务。蛋白免疫沉淀可以阐明蛋白-蛋白相互作用在信号转导中的重要性。

您将了解如何通过免疫沉淀识别蛋白质的相互作用,并克服与此技术相关的生化问题。

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网络研讨会主题:

  • ​样品制备
  • 阴性、阳性对照设计
  • 不同的结合和洗脱技术
  • 升级的 IPs
  • 相互作用的验证(酵母-双杂交/突变分析/质谱/western blotting)
  • 相互作用功能评估
  • IP 技巧和提示


主讲者介绍:

Seán Garry

SeánGarry于2006年获得都柏林圣三一学院的遗传学学位,并继续在都柏林大学康威学院的Margaret McGee博士实验室攻读博士学位。 Seán研究了促细胞凋亡的Bcl-2家族成员Bim如何在长期有丝分裂停滞后被磷酸化。

获得博士学位后,Seán搬到剑桥大学遗传学系的Viji Draviam博士实验室,开展博士后研究,探讨在有丝分裂过程中如何建立动粒 - 微管附着。

Rachel Imoberdorf

Rachel Imoberdorf在瑞士伯尔尼大学学习生物学。 之后,她移居瑞士日内瓦,在M. Strubin教授的实验室里获得了分子生物学博士学位。

在论文中,Rachel有兴趣了解全球组蛋白乙酰化对酵母酿酒酵母中转录调控的影响。 她还致力于开发一种系统,以测量基因组中特定区域的转录因子更新。

Rachel目前是Abcam的首席科学家,并在我们的实验室建立了IP,因此我们可以使用这种技术定期测试我们自己的抗体。


wangluoyantao:

女士们,先生们,您好,谢谢您的支持。今天演讲的主持人是来自Abcam的Sarah Dolny活动和市场协调员,他们将介绍:相互作用与否:免疫沉淀来回答这个问题。我现在把报告交给莎拉。

非常感谢您,Rick。今天的演讲者将是来自Abcam的Rachel Imoberdorf, Sean Garry和Judith Langenick。雷切尔在瑞士日内瓦大学攻读博士学位期间掌握了 IP 方面的知识。Rachel是Abcam的首席科学家,她在我们的实验室建立了IP。这种检测方法使实验室能够用这种奇妙的技术常规检测我们自己的抗体。肖恩在都柏林大学学院获得了博士学位,他花了无数的时间研究有丝分裂进程中的各种运动。在这之后,肖恩转到剑桥大学攻读博士后,在那里,他继续尝试识别酵母、双杂交和IP中的检查点所涉及的蛋白质。最后,Judith今天将加入我们。Judith在邓迪大学完成了她的分子生物学学位和博士学位。完成博士学位后,朱蒂丝前往剑桥大学分子生物学MRC实验室。Judith于2011年加入Abcam,是一名产品经理。

提醒一下,我们所有的演讲者将在本次网络研讨会期间收集您的问题,请您在屏幕的右侧面板上提交题。另外,PPT将在未来几天内通过电子邮件直接发送给您。此外,麻烦您在研讨会结束后收到的调查中,我们分享您关于这个网络研讨会和整个网络研讨会系列的想法。现在,我将把演讲交给我的同事Rachel。

RI: 欢迎来到我们的网络研讨会。在这一节中,我将对IP做一个简短的介绍,然后我将讨论如何建立一个IP实验以及如何找到完美的抗体。如何找到微珠上的抗体,我会讲到抗体滴定以及如何为IP western blot选择二级试剂。

尽管这是一个进阶IP网络研讨会,我想我们应该从这个问题开始:什么是IP? IP 是一种用于从复杂混合物中富集或纯化特定蛋白质的技术,例如,使用抗体的提取液。您能用IP做什么?您可以从一种复杂的混合物中分离出一种蛋白质,然后用在其他实验中。它也可以用来浓缩蛋白质,例如,如果您的蛋白质表达水平很低,可能需要IP来帮助蛋白在WB中的显示,或者您可以确定蛋白质-蛋白质在所谓的co-IP中的相互作用。在这项技术中,您所感兴趣的蛋白质将被免疫沉淀,然后您可以通过WB或质谱来检测其他蛋白质是否与您感兴趣的蛋白质共纯化。

在下一张幻灯片中,您可以看到一个典型的蛋白质印迹 IP ,这是我们在实验室中使用一种针对TBP的抗体进行的IP, TBP是一种TATA结合蛋白。由TBP创建的条带被红方块突出显示。您可以看到,与第一种提取液相比,第三种提取液中的TBP在IP中得到了很好的富集。此印迹包含所有典型的IP western blot对照。

让我们来谈一谈这些IP western blot对照。第一个泳道是初始提取物,这是用来确定目标是否可以在初始提取物中被检测到。但情况并非总是如此,有时需要通过IP富集才能使蛋白质能被观察到。第二个泳道是免疫沉淀后上清液。这是用来确定在目标蛋白是否免疫沉淀完全,并告诉您免疫沉淀的效率。第三个泳道是免疫沉淀样品,即实验结果。如果IP成功且高效,则相对于初始提取物,该条带将会很明显。第四个泳道是用lighter-type的对照抗体进行免疫沉淀的样品,该抗体与IP中使用的抗体为同源抗体,但不识别目标蛋白。因为它会告诉您在IP中看到的条带是由于抗体还是由于其对靶标的特异性。最后一个泳道是微珠对照,除了抗体,所有的东西都加需加入。在您的实验中加入这种对照同样重要,因为它会告诉您IP中是否有条带是由于蛋白质与微珠的非特异性结合造成的。

在简短的介绍之后,我想告诉您如何建立一个IP实验。建立一个IP实验最重要的两个步骤是找到完美的抗体。这绝对是关键,因为如果您的抗体在IP中不起作用,您的实验就不会成功。一旦您找到了您 IP 的完美抗体,您就需要确定您实验的正确条件。让我们从寻找完美的抗体开始。

最好的开始方法是检查PubMed中是否有其他研究人员使用抗体来标记您感兴趣的蛋白质的参考文献。例如,如果在所有数据表中,一种抗体的不同抗体供应商都对它进行了IP测试,这在实验应用处可见。此外,还要检查是否有关于IP的客户评论,这些评论很有帮助,因为它们通常能让您很好地了解抗体的工作原理。在我们的数据表中,这些可以在这里的AbReview部分找到。

如果没有经过IP检测的抗体,这些是您要注意的事:在IP中,靶蛋白通常是原生构象,因此,IP抗体需要识别蛋白外露表面的表位。此外,由于它是一个下拉反应,抗体也需要对表位具有高亲和力。因此,如果您要寻找一种在IP中起作用的抗体,就需要检查免疫原是否在蛋白的外露表面。但您只能在目标蛋白的结构和产生抗体的免疫原已知的情况下这样做。如果抗体在ChIP或免疫组化(immunohistochemistry, IHC)中起作用,则是检测IP是否成功的其他良好指标,因为这些技术对抗体的要求与IP类似。

我们经常遇到的一个问题是:我应该选择多抗还是单克隆抗体?多克隆抗体和单克隆抗体都可以成为优秀的IP抗体,但各有优缺点。单克隆抗体是针对单个表位的,而多克隆抗体由识别不同表位的抗体池组成。因此,多克隆抗体在IP中起作用的概率高于单克隆抗体,但这并不意味着该单克隆抗体在IP中不起作用。由于单克隆抗体的制造方式的特点,它们有批间变异较小的优势。由于多克隆抗体需要通过免疫另一种动物进行重组,因此更容易出现批间变异。我们对每个批次都做了大量的测试,以确保每个新批次都能与上一个批次相媲美,但是批次之间的细微差别几乎是无法避免的。

现在已经介绍了如何找到完美的抗体,我们将讨论下一步:抗体与微珠的结合。您首先要确定您要用哪种微珠。通常有两种类型的微珠:琼脂糖微珠,已被使用很长时间了,并且易于使用和设置。另一种是磁珠,它也方便使用,但您需要有正确的磁铁。这些微珠的优点是不需要离心,它们的孵育时间短,很容易去除上清,而且它们很容易扩展以提高产量。

一旦您决定了您需要哪种载体,您就需要决定应该使用哪种类型的Ig结合蛋白。最常用的Ig结合蛋白是细菌蛋白:蛋白A和蛋白G。这些蛋白与抗体的FC部分结合,根据抗体的种类和同型,它们的亲和力不同。正如您在这个表格中看到的,兔IgGs与蛋白A和蛋白G的亲缘关系相似,因此两者都可以用于兔抗体的IP。另一方面,与蛋白a相比,蛋白G对小鼠IgG1抗体的亲和力更高,因此,对于带有这种抗体的IP,可以选择蛋白G。有一些表格可以帮助您确定蛋白质A和/或G是否是您的抗体更好的选择。网页上表格的链接在这个黄色表格下面。

一旦确定了抗体、支持物和IgG结合蛋白,就可以开始进行实验。我们经常遇到的一个问题是,这些组件应该以什么顺序添加?首先,将抗体首先与微珠结合,并在加入提取物前清洗微珠复合物是一种较好的做法。其原因是在抗体的Fab和FC部分之间存在蛋白酶裂解位点,如果您的抗体部分降解,您最终会得到Fab片段,它们能够与目标蛋白结合,但不能与微珠结合。这意味着您将失去一部分靶蛋白。如果抗体先与微珠结合,然后清洗,这些Fab片段被洗掉,只有能够与微珠结合的抗体才会被添加到提取液中。

我现在已经介绍了如何选择微珠,并将介绍抗体滴定。我们经常遇到的一个问题是在IP反应中应该使用多少抗体?测定所需抗体的最佳方法是滴定实验。500µg提取物中含有1 - 10µg抗体通常是一个较好的选择。这里还要考虑的一件事是要有一个好的抗体微珠比;太多的微珠,会产生背景,太少,会失去一些抗体。

IP实验的另一个重要步骤是选择western blot的二级试剂。其原因是通常在洗脱步骤中,不仅是目标蛋白,抗体也从微珠上被洗脱。抗体会在蛋白质印迹中产生55和25 kDa的条带,分别由重链和轻链产生。

所以如果您使用一种与蛋白质印迹的IP抗体为同一物种得到的一抗,那么二抗不仅能识别一抗,还能识别blot上存在的变性的重链和轻链的IP抗体。这导致蛋白质印迹在55和25 kDa处出现大的黑色条带,这将会干扰您对目标蛋白或想要共免疫沉淀的蛋白的检测。

目前有几种解决上述问题的方法。方法之一是使用来源于不同物种的IP抗体与蛋白印迹一抗,确保二抗特异性识别一抗,而不会识别IP反应中附着于蛋白复合体表面的其它抗体。遗憾的是,有些蛋白难以获得与IP抗体来源物种不同的一抗。此外,对于分子量在30 kDa以上的蛋白,我们还可以使用特异性抗轻链的二抗。由于这样的抗体仅结合一抗的轻链,因此(目标条带外)只会在WB凝胶上约25 kDa的位置产生一条条带。在这里的示例中,我们利用抗HDAC2的抗体进行了免疫沉淀,用同抗体作为蛋白印迹的一抗,并用特异性抗轻链的二抗孵育。您可以看到,图中仅在25 kDa处出现了条带,而55 kDa处无条带。我们的网站上展示有一系列特异性抗轻链的二抗商品,稍后Judith会对此进行更详细的介绍。

另一种方法是使用构象特异性抗体,该类抗体特异性识别天然构象的,而不会识别膜上的变构抗体。我们建议使用其中的VeriBlot进行免疫沉淀实验。在这张IP的蛋白印迹实验结果图片中,我们利用VeriBlot作为二抗,您可以看到,IP反应仅产生了与目标蛋白组蛋白对应的17 kDa处的条带,而没有与轻链和重链分别对应的2555 kDa处的条带。

综上所述,免疫沉淀可应用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。应用于免疫沉淀的抗体需要能识别目标蛋白外表面的表位,且与目标蛋白有高亲和力;微珠的蛋白A/G包被要根据IP抗体的来源物种与血清型来选择。建议先将抗体与微珠结合;二抗的选择是IP免疫印迹实验的关键。

在交棒给我的同事Judith之前,我想再提醒一句:如果您在研讨会中有任何问题,只需在屏幕右侧的Q&A框中输入后提交即可。感谢各位的聆听。

JL:大家好。刚才Rachel也提到了,现在是测试时间,让我们看看各位对免疫沉淀掌握得如何了。测试题将会出现在各位屏幕的右下角,您有2分钟来回答这3个问题,感谢您的参与。答案将在问答环节结束后公布。接下来让我们把时间交给Seán

SG:谢谢RachelJudith。在本环节中,我将会讨论RIPANP-40缓冲液、翻译后修饰的维持、缓冲液体系优化、蛋白过表达、生物信息学以及对蛋白质-蛋白质相互作用的确认。

由于细胞有内源性蛋白的表达,我们需要优化检测蛋白质相互作用的流程。假设我们使用300μg的全细胞蛋白提取物进行免疫沉淀。如果我们通过蛋白印迹没有发现相互作用,提高样品量最高至2mg,或者使用亚细胞成分分离的样品后均可能提高检测到相互作用的可能性。根据目标蛋白的亚细胞定位,使用分离的核、线粒体、胞质或膜蛋白的分离组分,会(相对)提高目标胞内蛋白的样本量,进而提高检测到相互作用的可能性。今天我们不会涉及亚细胞水平的分离,在网络上也可以找到大量的操作流程。我们列出了一些已发表的分离各个亚细胞组分的流程。 

您需要根据免疫沉淀的目标蛋白来选择细胞裂解液。使用含有RIPA缓冲液的裂解液进行免疫沉淀能获得较低的背景信号,但可能造成部分激酶变性,以及可能干扰一些蛋白质-蛋白质互作。RIPA缓冲液能快速高效地裂解贴壁与悬浮培养的哺乳类细胞,并增溶蛋白。RIPA是一种被广泛应用于裂解与清洗的缓冲液,它不会对绝大部分的抗体与蛋白抗原造成不利影响。此外,RIPA缓冲体系的裂解液能将非特异性的蛋白相互作用降到最低以降低背景;同时还保持了绝大部分特异性的相互作用,可以利用其进行相关蛋白互作的研究。

样品制备完毕后,需即时向RIPA缓冲液中加入添加剂。添加剂包括EDTA(金属配合物与磷酸酶抑制剂)和氟化钠(丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂,作用是防止蛋白降解)。激酶与磷酸酶抑制剂将在下面的幻灯片进行讨论。将RIPA缓冲液于4°C下孵育可以维持蛋白质-蛋白质相互作用和激酶活性,并防止蛋白酶、激酶和磷酸酶的活化。有些种类的细胞可能需要额外的裂解步骤,通常会进行短时间的超声处理。注意,在超声处理时需要将细胞置于冰上。

对于一些蛋白质而言,RIPA裂解缓冲液中的去污剂含量较高而可能导致其过于强力,因此可能需要选择其它缓冲液。NP-40缓冲液引起的变性较少。然而,用其进行免疫沉淀可能导致更高的背景和非特异性的蛋白质结合。NP-40缓冲液抑制激酶活性和变性蛋白质复合物的能力较弱,并且除了Tris 盐酸、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠之外,其余成分与RIPA缓冲液相似。与RIPA缓冲液类似,使用NP-40缓冲液前应添加EDTA、氟化钠和磷酸酶抑制剂以保证蛋白质完整性和翻译后修饰。

细胞裂解完成后,需要对蛋白质裂解产物进行预清洗。对照组的IgG与微珠将会排除在随后的IP步骤中发生非特异性结合的可能性。细胞裂解后,将裂解产物与结合了对照IgGA/G琼脂糖微珠在4°C下共同孵育1-2小时。预清洗完成后,您就可以使用提取物进行免疫沉淀实验了。

接下来,我将讨论对翻译后修饰的维持。蛋白质-蛋白质相互作用可能依赖于翻译后修饰。因此,保持细胞裂解产物的蛋白质磷酸化、泛素化和甲基化,对于维持蛋白质-蛋白质相互作用进而成功完成免疫沉淀十分重要。因此,我们有必要确保裂解细胞不会导致翻译后修饰的消失,而裂解缓冲液中的一系列蛋白酶、磷酸酶和激酶的抑制剂都可以帮助维持翻译后修饰。

对于某些我们感兴趣的蛋白而言,可能需要在裂解缓冲液中加入特定的磷酸酶抑制剂,常用的几种如正钒酸钠、β-甘油磷酸盐、冈田酸和氟化钠。此外,每次裂解细胞前都需要向裂解缓冲液中添加新鲜的磷酸酶抑制剂,这对确保维持翻译后修饰十分重要。

细胞膜的破坏可导致内源酶(如蛋白酶)的活化,这可能会降解目标蛋白并影响免疫沉淀效果。因此,向细胞裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂对于维持在体环境下的蛋白质相互作用非常重要。由于蛋白酶的反应特性不同,实际可能需要使用多种蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。在裂解缓冲液中添加的蛋白酶抑制剂应足以防止样品降解。或者可以使用复配的蛋白酶抑制剂,以解决需将多种蛋白酶抑制剂分别添加到裂解缓冲液的问题。蛋白酶抑制剂复配剂中可能含有多种蛋白酶抑制剂,包括PMSF、抑肽酶、白介素和胃蛋白酶抑制剂。即使裂解缓冲液中加入了蛋白酶抑制剂,样品中蛋白质仍可能发生降解。在实验全程中将样品放在冰上可以避免这种情况。

如果您对目标蛋白的甲基化或泛素化感兴趣,可能需要使用一系列的抑制剂抑制去泛素化酶或金属转移酶,以保持蛋白质的状态与体内状态一致。和磷酸酶抑制的情况类似,去泛素化酶或金属转移酶的抑制剂需要在实验时即时添加到裂解缓冲液中。

接下来,我将讨论免疫沉淀中的孵育、洗涤和缓冲液优化。由于一抗的解离能力、目标蛋白的丰度存在差异,一抗结合目标蛋白所需的时间可能不同。从预清洗完蛋白质裂解物开始计时,在4℃下一抗的孵育可能需要114小时。

尽管在12小时后90%的蛋白质可能已经与抗体结合,但我们仍需要花更多时间让反应完成,以确保完全的目标蛋白俘获。但是,蛋白质提取物与一抗的过度孵育又会导致非特异性结合或蛋白质聚集。为了避免这个问题,您可以尝试将所需的时间优化为在不引入非特异性结合的前提下结合50%目标蛋白的时长。

抗体在最优条件下与目标蛋白进行结合之后,下一步便是从蛋白质裂解液中将蛋白-抗体结合物分离出来。由于在琼脂糖/琼脂糖凝胶微珠上附加了额外的重量,得到的蛋白-抗体复合物将能在重力、磁力或瞬时离心的作用下沉淀于管底。您需要对蛋白-抗体复合物进行清洗,以除去非特异性结合的蛋白质以及可能被认为是蛋白质沉淀的琼脂糖/琼脂糖凝胶微珠。与裂解缓冲液类似,洗涤缓冲液含有Tris盐酸、EDTAEGTA、氯化钠、Triton X-100、原钒酸钠以及复配的蛋白酶抑制剂。

IP洗涤缓冲液的主要作用是在保留所需的蛋白质-蛋白质相互作用的同时,去除非特异性的蛋白质结合。将CHAPsNP-40Triton X-100等温和的去污剂加入缓冲液中,可以降低印迹中的背景。如果强力的非特异性相互作用仍然存在,则可以通过提高氯化钠浓度来减少离子和静电相互作用,从而破坏亲核作用或二硫键。此外,还可以添加少量的还原剂,例如DTTβ-巯基乙醇。

理想的裂解缓冲液需要能够保持蛋白质的天然构象,最大限度地减少抗体结合位点的变性,同时从样品中释放出足量的蛋白质用于后续分析。然而,如果要减少非特异性的背景染色或是维持蛋白质的天然功能,缓冲液可能还需要进一步的优化。增加盐浓度能降低非特异的蛋白质-蛋白质相互作用。细胞裂解不足也可能导致非特异性结合引发的背景的存在。增加非离子和离子去污剂的浓度将分别增加细胞裂解和核溶解的程度。然而,增加去污剂的浓度也可能对蛋白质的构象造成破坏,因此可能需要进一步优化该步骤。如果您要从蛋白质裂解液中对激酶进行免疫沉淀的话,可能需要对二价阳离子浓度进行优化以保留目标激酶的全部功能。增加裂解缓冲液中EDTA的浓度将有助于磷酸酶功能的保留。最后,维持缓冲液的pH值也能保护蛋白质的功能。如果您的裂解液或洗涤缓冲液在一定时间内被未使用过,则可能需要检测缓冲液的pH值。

IP洗涤步骤后,您需要将蛋白质和抗体与A/G琼脂糖微珠分离开来。为了从微珠中除去蛋白质复合物,您需要在2 x SDS上样缓冲液中加100mM DTT,并将样品在95℃下孵育5分钟,沉淀微珠并将上清液转移至新离心管中。或者,您也可以在2 x SDS上样缓冲液中将蛋白质复合物在65°C下孵育10-20分钟后沉淀微珠,将上清液转移至新的离心管中。这可以避免较高温度下孵育所引起的蛋白质降解。

从琼脂糖微珠中分离变性蛋白是向SDS-PAGE凝胶上样前的重要步骤。与IP洗涤步骤相似,该步骤(分离变性蛋白)同样可以通过离心样品,将微珠沉淀在管底来实现。蛋白质混合物仍将悬混于微珠上层的SDS缓冲液中。瞬时离心后,在不扰动微珠的情况下小心移出上清液。您可以沿着离心管的侧面伸入Gilson移液管的尖端来避免扰动微珠。但是,如果您不小心将微珠吸取到上清液中,您可以一直重复此过程以确保将微珠完全去除。在将上清液转移到新管中后,您现在可以向SDS-PAGE凝胶上样了。如果不慎将微珠加入凝胶的加样孔中,可能会影响样品在电泳时的移动,并可能会影响到随后蛋白印迹实验的条带结果。

接下来,我将对比讨论对内源性蛋白与过表达蛋白质的免疫沉淀。内源蛋白的免疫沉淀结果与过表达或重组蛋白的结果相比可能会有些差别。这可能是由于重组蛋白或标签蛋白聚合并因此影响蛋白质复合物的结果,或者是因为标签蛋白过表达至高于正常生理水平。

与所有技术一样,免疫沉淀有利有弊,其中一些与内源性蛋白有关。内源性蛋白质浓度可能不足以进行IP。然而,蛋白质-蛋白质相互作用将按照生理条件下的比率发生,因此提供了在体情况的真实重现。由于内源性蛋白质的水平(较低),可能需要增加一抗的量以沉降相互作用的蛋白质复合物。这从而可能会带来成本和体系稠度的增加。最后,您的目标蛋白质可能与重链或轻链的分子量相同,这时IP会掩盖发生的相互作用。

虽然对蛋白质进行过表达可能会克服内源蛋白的问题,但仍存在一些优缺点。对蛋白质过表达或许可以克服内源性蛋白质的水平问题,然而,过表达的蛋白质可能高于生理水平,因此实验结果可能并不代表真实的体内相互作用。对于过表达的蛋白质,可以使用抗重组抗体进行沉降。最后,在蛋白质上添加标签可能会增加蛋白质的分子量,从而防止蛋白印迹过程中重链或轻链条带的掩蔽。此外,抗靶蛋白的抗体还可以同时沉降内源性蛋白和标签蛋白,从而提高IP的筛查能力。

接下来,我将讨论使用生物信息学方法来确定相互作用的蛋白质(interactor)。在过去几年中,生物信息学家已经创造了许多可以预测蛋白质-蛋白质相互作用的程序。这些程序基于已发表的文献、已知的相互作用的蛋白质、蛋白质序列以及结构和基因组学信息。这些程序有助于更深入理解生物分子间相互作用。尽管这些程序并不总是准确,但某些程序可能可以节省您的时间并预测您可能期望找到的蛋白质-蛋白质相互作用的类型。最受欢迎的帮助预测蛋白质-蛋白质间相互作用的网站是Eukaryotic Linear Motif FinderString 9.0The Biological General Repository for Interaction Datasets

Eukaryotic Linear Motif Finder是用于研究真核蛋白中候选功能位点的计算生物学资源库。在将多肽的信息输入到ELM工具中后,网站将分析该多肽的激酶、磷酸酶、泛素酶、甲基转移酶和类泛素化修饰酶的共有位点。对共有位点的鉴定将会提示可能发生翻译后修饰的位点,以及可能因此发生的特定蛋白质-蛋白质相互作用。

String 9.0是对已知蛋白质-蛋白质相互作用预测的数据库。这些相互作用包括了直接的和功能性的联系,来自于基因组数据、高通量分析、PubMed和共表达实验。蛋白质与图谱的交互也让您可以进一步推断通路中可能发生的相互作用。

接下来便是对交互作用的确认。其中一种方法是 X射线晶体照相术。使用结晶的重组蛋白,X射线晶体学可以确定蛋白质是如何相互作用的,互作涉及了哪些结构域,从而提供在体环境下这些生化相互作用的表征。其二是质谱分析。通过质谱法分析免疫沉淀出的蛋白质,可以使得我们鉴定信号通路上的多种相互作用的蛋白质。此外,对内源蛋白和标记重组蛋白的免疫沉淀可用于确定蛋白质-蛋白质相互作用。

其二是质谱分析。通过质谱法分析免疫沉淀出的蛋白质,可以使得我们鉴定信号通路上的多种相互作用的蛋白质。此外,对内源蛋白和标记重组蛋白的免疫沉淀可用于确定蛋白质-蛋白质相互作用。

酵母双杂交分析可以使得我们一次筛查多个目标。这种方法还具有真核系统的优势。酵母双杂交也可用于确定哪些结构域参与了蛋白质-蛋白质相互作用,因此使得我们可以进一步推断蛋白质是如何在信号复合体中相互作用的。

酵母双杂交是筛查蛋白质相互作用的一种好技术,但它也有优缺点。优点在于,酵母双杂交允许我们一次筛查多个目标蛋白。这是一种能复现出真核系统的在体技术。它允许对相互作用进行半定量地测量,并且仅需要提供目标基因的cDNA即可。利用酵母双杂交筛查相互作用的缺点在于,酵母中的翻译后修饰与人的细胞并不完全一致。实验中可能会产生假阳性结果,而且酵母双杂交还可能有毒性,因此并不一定总能验证相互作用的发生。

在鉴定完蛋白质-蛋白质相互作用后,可能还需要进一步的研究。这可以通过突变可能的相互作用结构域以及共有结合序列或结构域来进行。解构蛋白质也是鉴定相互作用的一种途径。然而,创建重组蛋白可能会导致蛋白质失去其天然构象,因此可能并不能代表真正的相互作用。

总而言之,免疫沉淀可用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。抗体的选择对于分离目标蛋白相当重要。为了观察到足量的相互作用,可能需要对蛋白质和抗体浓度加以优化。抑制翻译后修饰对于维持蛋白质-蛋白质相互作用也很重要。可能需要优化洗涤步骤以减少非特异性结合。最后,生物信息学可能有助于预测会发生相互作用的蛋白质。接下来,让我们把时间交给Judith

JL:感谢RachelSeán给我们带来了如此详尽的讲座。下面的环节由我来主持。我想借这个机会再给大家多介绍一些Abcam的免疫沉淀及蛋白印迹的资源,以及一些会对提高你们的实验有帮助的产品。兔单抗——或者叫RabMab——具有更高的亲和力和特异性,应用于蛋白质免疫印迹可得到高灵敏度、低背景的结果。这让兔单抗成为沉降实验的理想亲和试剂。RabMab还能够提供对多种人蛋白和鼠同源蛋白的抗原表位识别,所以也不需要另外设计替代抗体。如果您想了解更多,请访问www.abcam.cn/RabMAbs

OptiBlot系统给您提供了蛋白印迹实验中需要的一切,包括确保蛋白质加样量相等的试剂盒、加样简便且保质期长的电泳胶,以及蛋白质标准品LadderECL化学发光检测试剂盒。如果您想了解更多,请访问www.abcam.cn/OptiBlot

免疫捕获抗体试剂盒能够在保证在完整活性的状态下分离分子量较大的酶复合物,并且只需要相对少量的实验材料。这些试剂盒中的抗体与蛋白G-琼脂糖微珠可逆地交联,这让这些纯化酶可以用于随后的亚基组成和/或翻译后修饰分析。

对于更高要求的发表级别的蛋白印迹实验,我们推荐使用AbExcel二抗。这19种二抗都在Abcam实验室进行了广泛的测试,且都可与碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶结合使用。AP共轭产物的稀释倍数为1/5,0001/50,000之间,这让您可以用一份抗体产品进行超过1,500次印迹实验。对于辣根过氧化物酶结合抗体,每份产品可以进行600多次印迹实验。这些产品的平均稀释范围在1/2,0001/20,000之间。如果您想了解更多信息,请访问 www.abcam.cn/AbExcel.。

Rachel已经提到了针对IP产物的轻链特异及VeriBlot二抗产品。这些产品是利用蛋白印迹检测免疫沉淀或免疫共沉淀产物的理想选择。我们通常用这些产品来检测约50kDa(重链分子量)和25kDa(轻链分子量)的蛋白质。这些产品可与小鼠、兔子或山羊的一抗共同使用。如果您想了解更多信息,请访问www.abcam.cn/VeriBlot

如果需要快速简便地进行染色质免疫沉淀,我们推荐使用EpiSeeker ChIP试剂盒。在进一步介绍这些产品之前,需要指出这些试剂盒是用于交联ChIP的,而不能用于自然ChIP。 我们的一步法ChIP试剂盒和植物ChIP试剂盒分别针对哺乳动物和植物DNA样本进行了优化。这些试剂盒不含预选抗体,因此适用于任意靶标。EpiSeeker系列还包括了针对甲基化或乙酰化组蛋白修饰优化过的试剂盒。我们也提供针对甲基化DNA的免疫沉淀试剂盒。如果您想了解所有试剂盒的概况,请访问www.abcam.cn/EpiSeeker

为了帮助您进行蛋白印迹和IP实验,我们提供各种免费资源,包括关于IP的介绍、关于蛋白印迹和荧光蛋白印迹的网络研讨会、关于染色质、UV交联和RNA免疫沉淀的指南,以及IP实验中的排错技巧。如果您对这些资源感兴趣,请给我们发送电子邮件,或打开我们在网络研讨会结束后发送给您的链接和PDF。另外,欢迎随时在www.abcam.com/Posters浏览我们的文献及海报图书馆并下载相关副本。或者您也可以在abcam.com上发送邮件请求,我们会提供免费的印刷本。

Abcam的科学支持团队随时待命为您解答任何疑问。团队成员提供多种语言的支持服务,包括法语、西班牙语、德语、中文和日语。您可以在美国、英国、香港和日本与他们取得联系。

如果您想与我们当面交流,Abcam会组织一系列会议。比如您可以参加我们424日在伦敦举办的为期一天的线粒体、心血管系统和代谢综合症研讨会。如果您对这个会议感兴趣,请访问abcam.com/Mitochondria_April了解更多信息。我们还将于610日至11日在哈佛大学举办一场关于脑修复新途径的大会。有关这场会议以及所有活动的更多信息,请访问www.abcam.cn/Events

为了感谢您参加本次网络研讨会,我们会为您提供适用于所有AbExcelVeriBlot二抗、EpiSeeker试剂盒、OptiBlot试剂和RabMAb25%特惠折扣。您只需要在下订单时输入促销代码IPTBIW7即可享受此优惠。现在我要把时间交给RachelSeán,他们会回答你们在网络研讨会期间提交的问题。

RI:谢谢你,Judith。非常棒,我们收到了很多问题。谢谢大家。由于时间原因,我们只能回答其中的一些问题。对于那些提问而没来得及被回答的人,我们将在下周左右通过电子邮件与您联系。那么我们的第一个问题来自Gerhardt:我们可以同时加入蛋白质抗体微珠吗?答案是肯定的,可以,但这不是最好的做法。最好先将抗体与微珠共同孵育,使两者结合,之后您可以洗掉任何的Fab片段,以及抗体或微珠缓冲液中的任何物质。这样您加到蛋白提取物中的缓冲液就只有您想要的物质了。

SG:我们接下来的问题来自Michael:请问EDTA在裂解缓冲液中的作用是什么?嗯,Michael,我们在缓冲液中添加EDTA有两个原因。首先,这是为了抑制磷酸酶的活性——如果您看到您的蛋白质去磷酸化并且这成为实验中的问题的话。其次,加入EDTA是为了结合钙和镁离子,以防止它们对您的蛋白质IP产物或之后加入的任何试剂产生影响。

RI:下一个问题是Kaya提出的,他想知道使用共价结合试剂盒有什么好处——这种试剂盒不需要蛋白质A/G微珠就能与抗体结合,也不用担心同种型的问题。这是一个非常好的问题。这些共价结合的试剂盒非常好,因为当抗体共价结合时,当您进行洗脱的时候,抗体会粘附在珠子上,因此不会对蛋白印迹产生任何干扰。另一个优点是试剂盒已经为您确定了抗体微珠的比例,因此您将它们从冰箱中取出就可以直接使用了。

接下来是来自Sarah的一个问题:使用磁珠替代琼脂糖微珠有什么好处?使用磁珠实际上有很多优点。其中之一是,如果您使用了磁珠,磁铁会将珠子吸引到管子的一侧,这意味着取出上清液会非常容易。因此,如果在一个实验中您必须得取出所有的上清液,磁珠是一个不错的选择。此外,使用磁珠没有离心步骤,并且由于磁珠非常微小,您可以使用非常短的孵育时间,如果您的蛋白质不是很稳定,这可能会有所帮助。

然后是来自Ishmael的问题:我们可以在蛋白印迹中使用与IP相同的抗体吗?在这里,我想说,是的,可以——但首先您必须确保它适用于蛋白印迹,因为不是所有的抗体都适用于蛋白印迹。之后您需要为此选择合适的二级抗体,因此我们建议在IP中对所有大于30 kDa的蛋白质使用轻链抗体,而对任何小于30kDa的蛋白质使用VeriBlot

SG:我们的下一个问题来自Anya,她的问题是:在免疫共沉淀中,是什么保证了相互结合的两种蛋白质是特异性结合的?Anya,不幸的是,在现在的IP实验中,我们不能保证这一点。但是,阳性结果还是表明了有生化反应或相互作用很可能正在发生。然而,对于IP而言,其实验结果可能需要进一步验证。您可以用一系列实验进一步验证这一点,比如我提到过的X射线晶体成像术,酵母双杂交相互作用实验,或是荧光共振能量转移。还可以通过检查检测两者相互作用对于细胞周期的依赖性来进一步验证。您可以使用小分子抑制剂抑制该途径。这些试剂可以从Abcam Biochemicals获得。最后,您可以尝试逆向反应,看看是否在沉降了结合的另一个蛋白质后,相互作用仍会发生。

我通过Facebook得到的另一个问题来自Hernando:对于如何在免疫沉淀抗体结合后更好地修复肽或蛋白质,你是否有什么建议?Hernando,有三种常用的方法:使用尿素、STS或甘氨酸缓冲液洗脱技术。STS缓冲液洗脱最为强力,它将洗脱与目标蛋白非共价结合的抗体和抗体片段,因此几乎可以完全修复蛋白质。但是,如果您准备对免疫沉淀的蛋白质开展生化实验,我们建议您一直使用甘氨酸。如果您准备进行质谱分析,您可以使用再洗脱缓冲液。这可能很有用,因为再洗脱缓冲液与后续的蛋白质消化是兼容的。我们今天的时间就只够回答这么多问题了。Rachel刚刚也说了,我们应该会在未来几天内通过电子邮件回答您的问题。最后,我把时间交给Judith

JL:好的,我想你们一直在等这个时刻。这是测验的答案。关于问题一:蛋白A与哪种大鼠IgG同种型结合?正确答案是答案四:IgG2c。如果您想再次回顾这个问题,或者您答错了,我们会在网络研讨会结束后给您发送幻灯片。您可以回顾第14张幻灯片,这里列出了何时使用哪种类型的IgG结合蛋白。或者,您也可以访问我们的网站查看同型表。关于问题二:蛋白A是哪种蛋白酶的抑制剂?正确的答案是第一个,它是胰蛋白酶抑制剂。问题三:您现在有免疫沉淀得到的超氧化物歧化酶2,它是大小为25 kDa的蛋白质。您是用兔多克隆抗体得到的,并想在免疫印迹分析中使用与IP相同的抗体。您会使用哪种二级抗体?您或许为了这些试剂绞尽脑汁,但是正确答案是第四个二抗:用于IP的抗兔IgG VeriBlot试剂。我们建议使用此产品,因为它仅识别天然的、非还原的一抗。同样,如果您想了解更多信息,请访问www.abcam.cn/VeriBlot

最后,我要感谢RachelSeán参加本次研讨会,并感谢大家的参与。非常感谢大家提出的所有问题,我希望您能在不久的将来与我们一同参加下一场Abcam网络研讨。

女士们先生们,今天的网络研讨会到此结束。感谢您的时间和精力,现在可以下线了。感谢大家,祝大家愉快!

Seán Garry
Seán received his degree in genetics from Trinity College Dublin in 2006 and continued into research by doing a PhD in the laboratory of Dr. Margaret McGee at the Conway Institute, University College Dublin. For his thesis, Seán investigated how the pro-apoptotic Bcl-2 family member, Bim, is phosphorylated following prolonged mitotic arrest. After his PhD Seán relocated to the laboratory of Dr. Viji Draviam at the Department of Genetics, Cambridge University, to carry out post-doctoral research into how kinetochore-microtubule attachment is established during mitosis. Seán joined Abcam in 2012.

Rachel Imoberdorf
Rachel studied Biology at the University of Bern, Switzerland. After this, Rachel moved to Geneva, Switzerland where she did her PhD in Molecular Biology in the laboratory of Prof. M. Strubin. During her thesis Rachel was interested in understanding the effect of global histone acetylation on transcriptional regulation in the yeast S. cerevisiae. She also worked on the development of a system to measure transcription factor turnover on specific regions in the genome. Rachel joined Abcam in 2005 as Senior Scientist and manages a team of 8 people who establish and optimize techniques and processes in the Abcam laboratory, including Immunoprecipitation (IP) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP).


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