WB 实验方案
细胞培养和组织样本的综合 WB 实验方案，包括化学发光法和荧光显色法检测。
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WB 法是一种广泛用于检测复杂样本中特定蛋白的技术。 WB 法是指该方案中描述的涵盖从蛋白分离到检测等各个步骤的完整过程。
该方案概述了使用化学发光或荧光方法从样品制备到检测的完整工作流程。 它包括裂解液制备、凝胶电泳、蛋白质转移、抗体孵育和成像的详细步骤。
该方法基于使用 SDS-PAGE 按大小分离蛋白质，然后转膜，并使用对靶蛋白具有特异性的抗体进行探测。 该指南适用于细胞培养和组织样本，并支持各种检测系统。
什么是蛋白质印迹法？
WB 法是分子生物学和生物化学中用于识别和定量靶蛋白的基石技术。 它将凝胶电泳与免疫检测相结合，使研究人员能够分析蛋白质表达、翻译后修饰和分子量。
方法 涉及按 规格对蛋白质进行电泳分离， 转膜 细胞膜上，并使用特定 抗体进行 检测 。 该方案旨在帮助研究人员以最小的背景噪音获得高质量的结果。 它包括样品制备、凝胶电泳、蛋白转膜、封闭、抗体孵育和检测的优化步骤。
该指南适用于各种样品类型，支持化学发光和荧光检测系统，适应各种实验需求。
这项技术的背景和原则是什么？
WB 通过SDS-PAGE按 规格 进行蛋白质分离， SDS-PAGE是一种用于从复杂混合物中分离蛋白质的 聚丙烯酰胺凝胶电泳 形式。 在此过程中， 十二烷基硫酸钠 使蛋白质变性并赋予均匀的 负电荷，从而导致带负电荷的蛋白质。 这种变性破坏了天然蛋白质结构，确保蛋白质仅通过 分子量 而不是通过形状或电荷分离，这对于准确分析至关重要。
然后将 变性 的蛋白质加载到凝胶上，并且当电流驱动它们的迁移时，它们通过电泳分离；较小的蛋白质移动得更快，从而实现基于 规格的分辨率。 电泳后，使用电场将蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上。 封闭剂防止非特异性结合，一抗靶向特定蛋白质。 与酶或荧光基团偶联的二抗使显像成为可能。 通过化学发光或荧光成像方式进行显色，可在膜上形成对应于目标蛋白存在及相对丰度的条带。 该方法具有高度特异性和灵敏度，是蛋白质分析的理想选择。
第 1 阶段 - 样品制备
在进行 WB 实验之前，确保抗体能够识别目标蛋白。 通常情况下，需要将蛋白从细胞或组织中提取出来并制备成裂解液。 可以用上样缓冲液将裂解液稀释分装，并冷冻保存在 -80°C 备用。
2
分离细胞并在裂解缓冲液中重悬。
-
每 1x107 个细胞加入约 1 mL 裂解缓冲液，制成悬浮液。
-
对于悬浮细胞：
- 离心（100–500 g，5 分钟，4°C）并用 PBS 洗涤、重悬沉淀细胞两次。
- 再次减速离心（100–500 x g，5 分钟，4°C）并在用冰预冷的裂解缓冲液中重悬细胞。
-
如果是贴壁细胞，先进行酶解或机械分离，再洗涤、减速离心（100–500 x g，5 分钟，4°C），裂解缓冲液重悬沉淀。
处理细胞过程中保持无菌状态。
3
裂解细胞悬液。
- 4°C 下，在裂解缓冲液中振摇孵育细胞 10 分钟。
- 超声处理悬浮液，破碎细胞。
超声处理的时间和强度因仪器而异，因此需要进行一些优化。
4
离心悬浮液，沉淀不溶物。
- 在 14,000–17 下以 000,5 g 的离心力离心悬浮液 4°C 分钟。
5
将上清液保存在置于冰上的新试管中。
- 沉淀可以丢弃。
该上清液即为裂解液。
7
将裂解液等量分装到几个离心管中。
- 每个试管中移入相同体积的裂解液。
留出足够的空间，加入足量上样缓冲液。
8
9
-80°C 下保存样品备用。
第 2 阶段 - 上样和跑胶
依据蛋白 Marker 条带判断样本中每种蛋白的分子量。
所需材料
- SDS-PAGE 凝胶（基于 Tris-甘氨酸、Bis-Tris 或 Tris 醋酸盐的凝胶）
- 分子量标志物条带（例如 ab116028）
- 跑胶装置
- SDS
- 跑胶缓冲液（如 Tris-甘氨酸、MES、MOPS、Tris-醋酸盐）
步骤
1
选择适合蛋白的 SDS-PAGE 凝胶，并设置跑胶装置。
- 根据蛋白的大小选择或制备凝胶和缓冲液系统。
- 将凝胶放入跑胶装置，并在装置中加入跑胶缓冲液，使凝胶完全被浸没。
表 1： 根据蛋白大小推荐的梯度凝胶化合物。 我们的实验室使用的是梯度凝胶，但也可以使用丙烯酰胺浓度固定的凝胶。
蛋白大小 | 凝胶和缓冲液系统推荐 |
|---|---|
10–30 kDa |
4–12% 丙烯酰胺梯度 Bis-Tris 凝胶 MES 电泳缓冲液 |
31–150 kDa |
4–12% 丙烯酰胺梯度 Bis-Tris 凝胶 MOPS 电泳缓冲液 |
> 150 kDa |
3–8% 丙烯酰胺梯度 Tris 醋酸盐凝胶 Tris 醋酸盐电泳缓冲液 |
表 2：推荐用于浓度固定的 Tris-甘氨酸凝胶的化学凝胶。 如果自己制备凝胶，需要进行一些优化；一般来说，分离凝胶的起始浓度以 10 - 15% 为宜。
小分子量蛋白 | 中等分子量蛋白 | 大分子量蛋白 |
|---|---|---|
> 4 kDa | 12–100 kDa | < 200 kDa |
20% 分离凝胶 | 10–15% 分离凝胶 | 8% 分离凝胶 |
Tris-甘氨酸电泳缓冲液 | Tris-甘氨酸电泳缓冲液 | Tris-甘氨酸电泳缓冲液 |
蛋白越大，丙烯酰胺在凝胶中的百分比越低。 这就会产生一种密度较低的多聚体，使得蛋白更容易通过。
设置跑胶装置时，务必正确插入正极和负极。
2
解冻并使裂解液完全变性。
- 解冻裂解液，然后将其存放在湿冰上。
- 100°C 下，将各裂解液煮沸 10 分钟。
裂解液解冻得越快越好，因为存放在冰上会改变它们的 pH 值。
3
将来自各样品的等量蛋白上样到凝胶中。
-
我们推荐：
- 10−40 µg 来自裂解液的蛋白
- 10−500 ng 纯化蛋白
小心上样，防止过载；否则可能会导致样品溢出到相邻的孔内。
注意移液器吸头不要触及样本孔的底部，否则条带会变形。
加入样本之前，确保孔直立。
上样后，在步骤 4 中制备的变性裂解液可以在 -20°C 下保存备用。
4
根据制造商的说明跑胶。
- 根据使用的机器和靶蛋白优化跑胶时间和电压。
制造商、凝胶成分和目标蛋白不同，理想的跑胶时间和电压也会有所不同。 蛋白越大，跑胶电压越高，跑胶时间也越长。
5
准备转膜时，从跑胶装置中取出凝胶。
- 使用凝胶刀小心地撬开装置并取出凝胶。
第 3 阶段 - 从凝胶转移到膜
电泳完成后，蛋白被转移（或“印迹”）到准备用于抗体孵育的膜上。 可使用硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯树脂 (PVDF) 膜。
和电泳一样，转膜也是通过施加电荷来实现的，因为电荷可以促使蛋白迁移。 蛋白从靠近负极的凝胶移向正极，并在正极与膜结合。
1
如果使用 PVDF 膜，将膜浸泡在甲醇中。
该步骤对于 PVDF 膜来说是必要的，但硝酸纤维素膜不需要。 由于 PVDF 天然具有疏水性，所以需要用甲醇活化才能使缓冲液有效通过。
2
将膜浸入水中，然后 4°C 下在转移缓冲液中浸泡 10 分钟。
3
将 SDS-PAGE 凝胶和膜装入转膜暗盒中。
- 凝胶靠近负极。
- 膜靠近正极。
- 用一个小滚筒按压去除气泡。
务必将滤纸切成与膜相同的大小。
有关转膜装置设置的详细指南，请参阅制造商的说明。
4
根据制造商的说明进行转膜。
理想的转膜时间和电压可能因制造商而异。 可能需要进行优化。
5
从转膜装置上取出凝胶和膜。
第 4 阶段 - 检查转膜是否成功（可选步骤）
可以通过对凝胶进行考马斯染色的方式来检查转膜是否成功。
使用预染色的蛋白分子量条带作为参考，初步比较 PAGE 凝胶和膜上的蛋白含量。
为了获得最佳结果，不建议在荧光显色法 WB 中使用丽春红 S 染色剂，因其可能导致高背景荧光，即使在大量洗涤后也依然如此。
所需材料
- 膜
- SDS-PAGE 凝胶
- 考马斯染色剂（例如 ab119211）
步骤
1
观察预染色的彩色分子量标志物条带。
- 膜上的彩色条带应清晰可见。
2
用考马斯染色剂对 SDS-PAGE 凝胶进行染色。
- 将凝胶浸入考马斯染色剂中并根据制造商的说明进行孵育。
- 用水充分洗涤，直到背景被去除。
- 蓝色条带代表凝胶上剩余的蛋白。
即使转膜成功，转膜后 SDS-PAGE 凝胶上仍然会有一些蛋白。 只要大部分凝胶透明即可。
第 5 阶段 - 封闭和抗体孵育
按照以下步骤进行抗体孵育。 如果在化学发光 WB 中使用上样对照抗体，剥膜后可以对同一张膜重复以下染色过程。
在荧光显色法 WB 中，可以根据以下步骤用多组抗体孵育膜。 上样对照抗体和检测抗体可以在同一张膜上使用，无需剥膜。
所需材料
-
封闭缓冲液（例如；含 3–5% 牛奶或 BSA 的 TBST 或非哺乳动物蛋白缓冲液）
-
洗涤缓冲液（如 TBST）
-
膜
- 偶联一抗
步骤
12 小时 15 分钟左右
1
将膜放入染色仪，并用封闭缓冲液覆盖。
- 对于荧光显色法 WB，室温下轻柔振摇孵育膜 1 小时。
- 对于化学发光 WB 实验，4°C 下轻柔振摇孵育膜过夜，或室温下孵育 1 小时
封闭缓冲液含牛奶或 BSA（3–5%，溶于 TBST 中）。
一般来说，使用 BSA 得到的结果更清晰，因为它含有的可与抗体发生交叉反应的蛋白较少。 有些抗体在牛奶中效果更好，因为牛奶含有的封闭蛋白种类更多。
如果这一点已知，抗体的官网说明书将提供封闭缓冲液方面的建议。
2
在封闭缓冲液中将抗体稀释至推荐的稀释度。
抗体的官网说明书通常会提供最佳稀释度建议。
如果没有，可能需要通过连续稀释找出最佳抗体浓度。
3
在封闭缓冲液中用一抗覆盖膜。
- 4°C 下轻柔振摇孵育过夜，或室温下孵育 1 小时。
孵育时间可能需要优化。
4
用洗涤缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
第 6 阶段 - 检测
孵育完成后，即可对 WB 进行成像。
化学发光检测的第一步是，在化学发光底物溶液中孵育印迹，促使存在 HRP 偶联抗体的地方发光。 印迹上的这些光带对应抗体结合，并且可以解析为印迹上的条带。 以往化学发光印迹使用基于 X 射线胶片的技术进行成像，但是这些技术大多被台式电荷耦合器件 (CCD) 成像仪所取代，后者的图像质量更好。
所需材料
- 用偶联抗体（如 Alexa-Fluor® 抗体）染色的印迹
- 70% 乙醇
- 无绒棉布
- 硅胶垫
- 滤纸（适合扫描干膜）
- TBST（适合扫描湿膜）
- 成像系统
Alexa Fluor® 是 Life Technologies 的注册商标。 Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。
步骤
1
使用无绒棉布沾取 70% 乙醇清洁成像扫描床。
尽可能保持扫描床清洁，避免背景荧光。
2
扫描成像系统中的膜。
-
扫描湿膜：
- 将膜放在扫描床上，蛋白面朝下。
- 在扫描区喷洒约 5 mL TBST。
- 在膜上放置硅胶垫，用滚筒去除气泡。
- 盖上盖子，并根据设备说明进行扫描。
-
扫描干膜。
- 将膜放在两张滤纸之间，用箔纸覆盖并放置干燥过夜。
- 将膜放在扫描床上，蛋白面朝下。
- 将硅胶垫放在膜上，确保膜放置正确。
- 盖上盖子，并根据设备说明进行扫描。
组蛋白检测用湿膜扫描效果更好。
3
扫描后，从扫描床上取下膜，并用无绒棉布沾取 70% 乙醇清洁成像扫描床。
尽可能保持扫描床清洁，避免背景荧光。
第 7 阶段 - 剥膜（可选步骤）
剥膜可以从膜上去除抗体，再用一组不同的抗体进行复染。 如果打算用上样对照抗体孵育膜，剥膜会大有帮助。
所需材料
- 剥膜缓冲液（如 ab282569）
- TBST
- PBS
- 膜
- ECL 检测试剂
步骤
约 30 分钟
1
用剥膜缓冲液剥膜。
- 在剥膜缓冲液中孵育约 20 分钟。
使用能够完全覆盖膜的缓冲液。
2
室温下用 PBS 洗涤膜 5 分钟。
3
用少量 ECL 检测试剂孵育膜。
- 孵育约 5 分钟，检查剥膜是否成功。
- 如果膜是透明的，则继续封闭并进行抗体孵育。
第 8 阶段 - 数据分析
通过预期分子量处的或预期分子量附近的条带可以鉴别蛋白，并基于蛋白 Marker 条带进行确认。 为了排除非特异性相互作用，阴性对照泳道中不应出现相同的条带。 例如，在上图中，我们看到阴性对照泳道没有靶标条带 (CD133)。
需要注意的是，条带可能与预期分子量不同，原因有很多，包括：
- 翻译后修饰（如磷酸化和糖基化）会增加蛋白的分子量。
- 剪接变体和亚型可能会生成由同一基因产生的不同大小的蛋白。
- 相对电荷：氨基酸的组成会影响蛋白在凝胶中的迁移距离。
- 多聚体：虽然强相互作用可能会导致出现分子量更高的条带，但在还原条件下通常不会出现这种情况。
如果条带的分子量超出预期或难以通过任何其他方式解析，请参阅我们的疑难解析指南。
与其他方法相比如何？
与酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或质谱分析等技术相比，WB 分析实现了特异性、敏感性和可视化确认的平衡。 ELSIA 为检测生物样本中的蛋白质、抗体或抗原提供了高度特异性和定量的数据，但对蛋白大小缺乏解析能力。
质谱法可以提供详细的蛋白质鉴定，但需要复杂的仪器和专业知识。 免疫组化可以在组织内定位，但定量能力不足。 WB 法将基于大小的分离与抗体特异性相结合，能够检测翻译后修饰和异构体，因此能够在各种方法中脱颖而出。 当侧重于蛋白质大小时，这种方法比质谱法更容易获得，且信息量比 ELISA 更大。 虽然不是高通量分析，但 WB 分析仍然是验证蛋白质表达和评估分子量的金标准。
主要应用是什么？
WB 法用于生物医学研究、诊断和生物技术。 它能够检测细胞裂解液或组织提取物中的特定靶蛋白，这对于研究基因表达、信号传导通路和疾病生物标志物至关重要。 研究人员用它来确认抗体特异性，验证基因敲低或过表达实验，并监测磷酸化等蛋白修饰。
WB 中的免疫检测可以识别复杂样本中的靶抗原。 它支持定性和半定量分析。 在临床环境中，WB 法有助于诊断感染和自身免疫性疾病。 WB 适应不同样品类型和检测系统，这使其成为蛋白质组学、细胞生物学和分子诊断的通用工具。 该方案支持从基础研究到转化研究的实验应用，包括蛋白质相互作用和结合特性的研究。
有哪些限制？
尽管 WB 法有其优势，但仍存在局限性。 它非常耗时，需要仔细优化从样品制备到检测的每个步骤。 灵敏度可能受抗体质量、转膜效率和封闭条件的影响。 所谓定量充其量是半定量的，结果可能因实验而异。 低丰度蛋白的检测可能需要信号放大或富集策略。 膜处理和成像可能会带来变异性。
此外，该技术仅限于可通过 SDS-PAGE 分离的变性蛋白。 它不提供诸如免疫组化之类的空间信息，也不提供诸如质谱法之类的全面分析。 适当的控制和验证对于可靠的解释至关重要。
疑难解答
WB 法的常见问题包括信号弱、高背景和条带失真。 信号弱可能是由于蛋白质浓度低、抗体结合不充分或转膜效率低造成的。 应确保适当的裂解、准确定量和优化的抗体稀释度。 高背景通常源于封闭不足或抗体浓度过高。
使用适当的封闭缓冲液并彻底洗涤。 反应孔上样过多、凝胶聚合不均匀或运行条件不正确都可能导致条带变形或模糊。 验证凝胶组分和上样量。 如果蛋白转膜不彻底，请检查膜活化和转膜设置。 一致的样本处理、清洁的设备和经验证的试剂是进行疑难解析和改善结果的关键。
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参考文献
- Begum， H.， Murugesan， P. & Tangutur， A. D. WB：科学和生物医学研究领域的强大基础。 生物技术 73， 58–69 （2022）。
- Mishra， M.， Tiwari， S. & Gomes， A. V. 蛋白纯化和分析：下一代 WB 技术。 蛋白质组学专家修订版 14， 1037–1053 （2017）。
- Sule， R.， Rivera， G. & Gomes， A. V. WB （免疫印迹）：历史、理论、用途、实验步骤和问题。 生物技术 75， 99–114 （2023）。
- Gilda， J. E. & Gomes， A. V. 提高蛋白质印迹法准确性信心的必要性和策略。 蛋白质组学专家修订版 11， 549–560 （2014）。
- Mahmood， T. & Yang， P. C. WB迹法：技术、理论和故障排除。 N. Am. J. Med. Sci. 4, 429–434 (2012).