IHC 抗原修复实验方案

抗原修复是免疫组化 (IHC) 中恢复福尔马林固定组织抗原性的关键步骤，包括通常用于保持形态的固定石蜡包埋组织。 本实验方案含有热诱导抗原表位修复 (HIER) 和酶法修复等抗原修复法，适用不同的组织类型和抗原。 这些技术可破坏固定过程中形成的蛋白质交联，使抗体能够有效结合。 本方案包含使用压力锅、微波炉和蒸锅的步骤，以及使用蛋白酶进行酶消化的步骤。 Abcam 还提供预配制缓冲液和通用试剂盒，以简化流程。 本指南可确保极佳染色结果，并支持为各种组织类型和抗原提供可重复的 IHC 工作流程。

简介

福尔马林固定可保持组织形态，但会导致抗原掩蔽，使 IHC 抗体无法接触抗原。 抗原修复通过破坏固定过程中形成的亚甲基桥来逆转这种掩蔽作用。 抗原修复的确切机制仍在研究中，其中可能涉及多种化学过程，例如甲醛交联键的水解裂解、抗原表位的展开和钙离子提取。 本实验方案提供一种使用高温或酶进行抗原修复的结构化方法。 所选方法取决于所用组织类型、抗原和抗体，而选择最佳方法通常需要通过实证检验。 本实验方案对于致力于在 IHC 应用中实现高质量、特异性染色的研究人员至关重要。 它还含有缓冲液制备指南和设备建议，可简化修复过程。

背景和原理

抗原修复基于恢复固定组织中的抗原表位可及性。 抗原修复技术是一种用于在福尔马林固定组织中显现抗原的方法，它可以改善免疫组化中的检测。 福尔马林固定会产生遮蔽抗原位点的交联。 热诱导抗原表位修复 (HIER) 使用高温和特定缓冲液破坏这些交联。 选择具有最佳 pH 值和成分的适用 HIER 缓冲液，如柠檬酸盐、Tris 或 EDTA，对于实现抗原修复效率最大化，同时最大限度地减小组织损伤至关重要。 热处理可以恢复固定过程中改变的表位构象，从而改善抗体结合。 酶法修复利用蛋白酶消化掩蔽蛋白；这个过程称为酶解，可破坏固定过程中形成的交联，以促进抗体进入，但可能存在组织损伤或非特异性染色的风险。 方法和缓冲液 pH 值的选择取决于抗原，通常需要经验优化。 Abcam 的实验方案强调可重复性，并包含经验证的试剂，以确保实验结果一致性。

便捷的缓冲液，有助于获得可靠的结果

为了获得热介导抗原修复的稳健结果，建议使用预配制的抗原修复缓冲液。 其中包括三种最常用的缓冲液——请从我们的柠檬酸盐缓冲液试剂盒、Tris-EDTA 缓冲液试剂盒或  EDTA 缓冲液试剂盒或 Tris 缓冲液试剂盒中选择。

我们还提供通用热介导抗原修复试剂盒（与我们领先的 PD-L1 克隆 28-8 配合使用），该试剂盒与大多数抗体兼容，无需多种缓冲液。 

或者，您可以制备自己的缓冲液和溶液，同样使用以下推荐方法。

用于热诱导抗原表位修复的缓冲溶液

下面是三种 HIER 较为常用的缓冲溶液 当抗体数据表上没有推荐的抗原修复缓冲液时，最好通过实验来确定。

柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠, 0.05% 吐温 20，pH 6.0）

• 柠檬酸三钠（二水合物）2.94 g
• 蒸馏水 1 L
• 混合溶解。 用 6.0 HCl 调节 pH 值至 1N。
• 加入 0.5 mL 吐温 20 并充分混合。 室温下可储存 3 个月或置于
• 4°C 下可储存更长时间。

1 mM EDTA，pH 8.0

• EDTA 0.37 g
• 蒸馏水 1 L
• 用氢氧化钠将 pH 值调节至 8.0
• 室温下可储存 3 个月

Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris base，1 mM EDTA 溶液，0.05% 吐温 20，pH 9.0）

• Tris 1.21 g
• EDTA 0.37 g
• 蒸馏水 1 L
• 混合溶解。 将 pH 值调节至 9.0。
• 加入 0.5 mL 吐温 20 并充分混合。 室温可保存 3 个月，置于 4°C 下可保存更长时间。

第 1 阶段 - 热诱导抗原表位修复 (HIER)

热诱导抗原表位修复通常需要使用压力锅、微波炉或蒸煮锅完成。 有些实验室使用设置为 60°C 的水浴槽，将载玻片置于修复溶液中孵育过夜。 在处理高温加热时会从载玻片脱落的组织切片时，这种方法非常有效；特别是骨、软骨和皮肤。