蓝色天然电泳（BN-PAGE，也称为蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳）可以分析天然状态下的线粒体蛋白复合物。该实验方案使研究人员能够使用基于考马斯染料的分离方法来确定这些复合物的大小、丰度和亚基组分。除了解析成熟复合物外，蓝色天然电泳还可以检测线粒体复合物的组装中间体，从而揭示这些结构的逐步组装过程。该方法采用二维凝胶系统，先从天然电泳开始，然后进行 SDS-PAGE 以进一步解析。 BN-PAGE 是研究多亚基酶和蛋白质相互作用的理想选择。 Abcam 的详细方案涵盖样本制备、凝胶浇注、电泳条件和免疫检测步骤，这使其成为蛋白质组学和线粒体研究的可靠资源。

简介

BN-PAGE 是一种专门的电泳技术，可在分离过程中以天然形式保存蛋白复合物。与使蛋白质变性的 SDS-PAGE 不同，BN-PAGE 使用非变性条件和考马斯染料使蛋白质带电而不破坏其结构。这样可以准确地分析完整的线粒体复合物。大多数蛋白质都是更大的多蛋白复合物的一部分，这凸显了 BN-PAGE 等技术的重要性。该实验方案特别适用于研究氧化磷酸化 (OXPHOS) 系统和其他多亚基组件。酿酒酵母是一种广泛用于线粒体蛋白质组学和复杂物组学分析的模式生物。该方案提供了从样本溶解到印迹显色的分步指南，确保给细胞生物学、生物化学和分子诊断领域的研究人员带来可重复性和清晰度。

背景和原理

Schägger 和 von Jagow 于 1991 年首次将蓝色天然电泳描述为一种根据大小和染料结合来分离蛋白质复合物的方法。考马斯蓝 G 与蛋白质结合，使其带有与其质量成正比的负电荷。这使得蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离时不会变性。该方案包括采用一维天然凝胶和可选的二维 SDS-PAGE 进行亚基分析。 BN-PAGE 特别适用于线粒体研究，在线粒体研究中，维持复合物的完整性至关重要。该技术将生化试剂精度与下游免疫检测的兼容性相结合，这使其成为蛋白质组学工作流程的基石。

试剂与设备

BN-PAGE 测试一抗
根据选择的检测方法适当偶联的二抗
电泳和 WB 试剂
10% 月桂酰基麦芽糖苷溶液（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷，ab109857）
6-氨基己酸、Bis-Tris、Tricine
考马斯蓝 G
立式丙烯酰胺电泳装置
全浸没式电印迹装置
酸度计、天平和其他标准实验室设备

缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液 (PBS)：

1.4 mM KH₂PO₄
8 mM Na₂HPO₄
140 mM NaCl
2.7 mM KCl, pH 7.3

蛋白酶抑制剂储备液（每份 1000）

1 M 苯甲磺酰氟化物 (PMSF) 的丙酮溶液
1 mg/mL 亮肽素
1 mg/mL 抑肽素

一维电泳阴极缓冲液

50 mM Tricine
15 mM Bis-Tris
0.02% 考马斯蓝 G
测定 pH 值并将 pH 值调节至 7.0

一维电泳阳极缓冲液

50 mM Bis-Tris
测定 pH 值并将 pH 值调节至 7.0

二维电泳运行缓冲液

25 mM Tris
192 mM 甘氨酸
0.1% SDS

SDS-PAGE 变性缓冲液

10% 甘油
2% SDS
50 mM 三羟甲基氨基甲烷，pH 6.8
0.002% 溴酚蓝
50 mM 二硫苏糖醇

Tris/甘氨酸或 Towbin 电印迹转膜缓冲液

25 mM Tris
192 mM 甘氨酸
10% 甲醇
0.1% SDS

膜洗涤缓冲液

PBS 加 0.05% 吐温 20

膜封闭液

PBS 加 5% 脱脂奶粉

碱性磷酸酶显色缓冲液

0.1 M 二乙醇胺 (DEA)
5 mM MgCl₂
100 mg/mL 50 NBT 储备液的 100% DMF 溶液
100 mg/mL 50 BCIP 储备液的 70% DMF 溶液
DMF 二甲基甲酰胺

缓冲液 A

0.75 M 6-氨基己酸、50 mM Bis-Tris/HCl，pH 7.0
1 µg/mL 亮肽素
1 µg/mL 抑肽素
1 mM PMSF
亮肽素储备液：1 mg/mL（水）
抑肽素储备液：1 mg/mL（乙醇）
PMSF 储备液：0.3 M（乙醇）
LM：正十二烷基-β-D-麦芽糖苷

第 1 阶段 - 样品制备

基本上按照 Schägger and von Jagow (1991), Analytical Biochemistry, 199, 223-31 的描述，进行蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN-PAGE)。

首先，用带电荷的（考马斯）染料对溶解的样品进行染色。然后根据结合的染料量（与样本大小成正比），通过电泳分离完整的线粒体复合物。这时，可以立即对该一维凝胶进行 WB，也可以用变性 SDS 缓冲液浸没凝胶后，再进一步二维分离已分解复合物的蛋白质组分。

进行蓝色非变性电泳时，我们始终建议在分析前从细胞中分离线粒体。可以探测整个组织或细胞提取物，但会导致信号变弱。

建议优化实验用的样本浓度。

步骤

1

在 0.4 μL 40 M 氨基己酸和 0.75 mM Bis-Tris（pH 50）中重悬 7.0 mg 沉淀线粒体。

2

加入 7.5 μL 10% 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。

3

混匀并在冰上孵育 30 分钟。

4

以 72,000 x g 的离心力离心 30 分钟。

对于小体积样本，建议使用 Beckman Optima 台式超速离心机。
但是，也可以使用台式微量离心机并设置为最大速度（通常约为 16,000 x g），但是效果并不理想。

5

收集上清液，并弃去沉淀。

6

在上清液中加入含 2.5 μL 5% 考马斯蓝 G 溶液/悬浮液的 0.5 M 氨基己酸。

7

加入蛋白酶抑制剂（如 1 mM PMSF、1 µg/mL 亮肽素和 1 µg/mL 抑肽素，参见缓冲液配方）。

第 2 阶段 - 非变性丙烯酰胺凝胶制备及一维电泳

非变性丙烯酰胺凝胶可以用手倾倒。虽然可以使用单一浓度的丙烯酰胺，例如 10% 纯凝胶，但我们强烈建议使用线性浓度的丙烯酰胺，例如浓度范围在 6–13%。使用双室梯度生成仪时，将该非变性丙烯酰胺凝胶倒入凝胶数为 10 块的 BioRad Mini-PROTEAN II 多板预制室的方法详见下文。

该步骤中的丙烯酰胺浓度可以调节，以优化目标复合物的分离。

步骤

1

手动或用机器倒入非变性丙烯酰胺凝胶。

使用双室梯度生成仪时，将这些非变性丙烯酰胺凝胶倒入凝胶数为 10 块的 BioRad Mini-PROTEAN II 多板预制室的方法以及推荐的丙烯酰胺 - BioRad 30% 丙烯酰胺/Bis 溶液37.5:1 详见下文。

配制 38 mL	配制 32 mL
6% 丙烯酰胺	13% 丙烯酰胺
7.6 mL 30% 丙烯酰胺	14 mL 30% 丙烯酰胺
9 mL 双蒸水	0.2 mL 双蒸水
19 mL 1 M 氨基己酸，pH 7.0	16 mL 1 M 氨基己酸，pH 7.0
1.9 mL 1 M Bis-Tris，pH 7.0	1.6 mL 1 M Bis-Tris，pH 7.0
200 μL 10% APS	200 μL 10% APS
20 μL TEMED	20 μL TEMED

虽然可以使用单一浓度的丙烯酰胺，例如 10% 纯凝胶，但我们强烈建议使用线性浓度的丙烯酰胺，例如浓度范围在 6–13%。

2

倒入后，用 50% 异丙醇溶液覆盖凝胶。

3

10 块凝胶都凝固后，倒出异丙醇，用水冲洗并从制胶室中取出凝胶。

4

使用浓缩胶和凝胶梳。

5 mL 量的浓缩胶配方：

0.7 mL 30% 丙烯酰胺
1.6 mL 双蒸水
0.25 mL 1 M Bis-Tris，pH 7.0
2.5 mL 1 M 氨基己酸，pH 7.0
40 μL 10% APS
10 μL TEMED

5

应在孔内上样 5–20 µL 样品。

电泳条件不同。但是，应在 150 V 下分离样本约 2 小时，或直到样品缓冲液蓝色染料几乎要从凝胶底部流出。

缓冲液配方部分描述了 BN-PAGE 阳极和阴极电泳运行缓冲液的配方。

第 3 阶段 - 二维电泳

可对一维凝胶进行 WB，并用抗体探测分离的线粒体复合物。如需进行此操作，请参阅下一部分。

也可以进一步将线粒体复合物二维（变性）分解成蛋白质亚基。完成后即可按照下述步骤进行电印迹检测。

步骤

1

从一维凝胶中切出每条凝胶泳道，并用 SDS 变性缓冲液浸泡。

请参阅配方下的 SDS 变性缓冲液配方。

2

每个泳道应旋转 90° 并上样至 SDS-PAGE 10-20% 丙烯酰胺凝胶的顶部。

这类凝胶应该更宽，以容纳一维凝胶板条。

第 4 阶段 - 电印迹和免疫检测

电印迹应使用全浸没式系统（如 BioRad Mini Trans-blot 系统）进行。建议使用 Tris-Glycine 转膜法对 BN-PAGE 凝胶进行印迹（详见缓冲液部分）。

我们还强烈建议使用 PVDF 膜（例如 Immobilon），而非使用硝酸纤维素膜。改变电印迹的电流和持续时间也可以改善部分蛋白质的分解和转膜效果。

步骤

1

电泳后，应用转膜缓冲液浸泡凝胶 30 分钟，然后再组装转膜夹层。

2

电印迹应在 150 mA 下进行 1.5 小时。

蓝色染料从凝胶完全转移到膜上表明电泳转膜效果良好。

3

应用 3% 牛奶/PBS 溶液封闭膜至少 5 小时。

建议在 4°C 下封闭过夜。

4

用含 10% 吐温 0.05 的 PBS 洗涤膜 20 分钟。

5

用 BN-PAGE 单克隆一抗孵育膜。

应用 1% 牛奶/PBS 孵育溶液稀释抗体至推荐浓度。
5 mL 抗体溶液足以覆盖 100 cm² 的膜，建议持续振摇/搅拌/旋转。

应按照官网说明书提供的推荐浓度使用一抗。但是，样本上样量较少时，特别是在分析作为物料来源的替代种属时，可能需要进行一些优化（通常需要增加一抗的浓度）。

6

用含 0.05% 吐温 20 的 PBS 溶液洗涤膜 5 分钟。

重复该步骤两次。

7

用二抗孵育膜，二抗应根据选择的检测方法适当偶联。

按照制造商推荐的稀释度，在 1% 牛奶/PBS 溶液中稀释二抗。

在该溶液中加入叠氮化钠作为防腐剂，否则后续溶液会抑制辣根过氧化物酶偶联二抗的活性。

二抗也有所不同，应针对您的系统进行优化。通常，对于市售酶偶联二抗，正常的稀释度是 1:1,000–10,000x。

强烈推荐碱性磷酸酶（AP）偶联二抗和辣根过氧化物酶偶联二抗。

8

用含 0.05% 吐温 20 的 PBS 溶液洗涤膜 5 分钟。

重复该步骤两次。

9

用 PBS 冲洗印迹，以去除任何可能抑制检测的吐温 20。

第 5 阶段 - 印迹显色

详情请参阅制造商说明书。

步骤

1

用补加 1% v/v BCIP 和 1% v/v NBT 的 AP 显色缓冲液孵育膜。

2

获得最佳信号前，持续显色。

3

用水冲洗印迹，终止显色。

详情请参阅制造商说明书。

步骤

1

用 HRP 显色溶液孵育膜。

孵育 2 分钟。

强烈推荐 ECL 系统，在该系统中，试剂 A 与试剂 B 的比例为 40:1。

2

用透明包装/保鲜膜覆盖膜，并在合适的暗室条件下暴露于 X 射线胶片进行胶片显影。

天然复合物分析

对天然复合物进行分析是揭示蛋白质复合物在细胞内错综复杂的结构和生物学作用的基础。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN-PAGE) 是一种分离和表征天然蛋白质复合物的稳健方法，包括膜蛋白复合物和线粒体蛋白复合物等具有挑战性的靶标。通过维持这些组件的天然结构，BN-PAGE 使得研究人员不仅能够评估复合物的大小和分子量，而且还可以评估其在生物样本中的相对丰度和组分。

BN-PAGE 的一个关键优势是其与下游蛋白检测方法的兼容性。分离后，可切除对应于天然复合物的蛋白质条带并进行质谱分析，这样就可以鉴定单个蛋白质和翻译后修饰。这种方法对于研究线粒体内膜蛋白复合物特别有价值，例如参与氧化磷酸化和细胞存活的呼吸链复合物。使用丙烯酰胺梯度凝胶可提高具有不同分子量的复合物的分辨率，同时严格控制蛋白质浓度和转移缓冲液条件可确保最佳的蛋白质分离和检测。

BN-PAGE 也有助于临床诊断，因为天然复合物的组分或丰度的变化可以作为疾病（包括神经退行性疾病）的生物标志物。通过分析患者样本中的线粒体蛋白复合物，研究人员可以深入了解疾病机制并识别潜在的诊断靶标。该技术在基础研究中同样有价值，它有助于研究从酵母菌株和细胞培养到分离的线粒体等系统中的蛋白质复合物组装、稳定性和功能。当与亲和纯化或凝胶过滤结合使用时，BN-PAGE 为剖析天然蛋白质复合物的分子细节提供了一个全面的平台，从而加深了我们对细胞过程和疾病的理解。

与其他方法的比较

与 SDS-PAGE 相比，BN-PAGE 具有保持蛋白复合物完整性的优势，可实现功能和结构分析。虽然 SDS-PAGE 仅依据分子量分离蛋白质，但 BN-PAGE 保留了天然的相互作用，这使其成为研究多亚基组装的理想选择。等电聚焦 (IEF) 提供了高分辨率，但需要较为复杂的设置，因此不太适合膜蛋白。由于考马斯染料的电荷增强特性，BN-PAGE 在灵敏度上也超过了透明天然 PAGE (CN-PAGE)。

应用和下游蛋白检测方法

BN-PAGE 广泛用于线粒体研究，特别是用于分析 OXPHOS 复合物。它使得蛋白质间相互作用、复杂的化学计量和翻译后修饰等研究成为可能。该技术适用于涉及线粒体功能障碍的疾病研究，如神经退行性疾病和代谢性疾病。它还支持蛋白质组学分析和生物标志物发现。该方案便于与 WB 法整合，从而实现基于抗体的特异性检测。研究人员可以将 BN-PAGE 应用于细胞系、组织和纯化的细胞器，使其成为基础和转化科学的灵活工具。

局限性

尽管 BN-PAGE 有其优势，但也存在局限性。该技术需要精心进行样本制备，以避免复杂的解离。考马斯染料可能会干扰下游质谱分析，除非将其去除。凝胶浇注和梯度形成在技术上要求很高，并且分辨率可能因丙烯酰胺浓度而异。此外，与分离的线粒体相比，全细胞提取物产生的信号可能较弱。通常需要优化抗体浓度和电泳条件。 Abcam 的实验方案通过详细的缓冲液配方和疑难解析技巧来应对这些挑战，但用户应该为迭代优化做好准备，以获得最佳结果。

疑难解答

BN-PAGE 的常见问题包括 WB 信号弱、凝胶背景呈蓝色以及复合物分辨率低。要提高信号强度，需确保线粒体分离，并优化样本浓度。使用新鲜的蛋白酶抑制剂并验证缓冲液 pH 值。蓝色背景可能由考马斯染料过量造成的，应降低染料浓度或延长洗涤步骤。如果蛋白质转移效率低下，调整电印迹电流和持续时间。 Abcam 建议使用 PVDF 膜并优化抗体稀释度。对于梯度凝胶，确保丙烯酰胺正确混合并完成聚合反应。疑难解析指南提供了实用的解决方案来保持结果的一致性和清晰度。