ChIC/CUT&RUN 染色质分析

本指南改编自 Claudia Semprich（英国巴布拉姆研究所）撰写的一篇文章，提供了 ChIC/CUT&RUN 的全面概述，与传统 ChIP 方法相比，它具有令人兴奋的优势。

染色质免疫切割技术改变了我们以高分辨率和低背景绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱的能力。 在 Laemmli 实验室的早期工作的基础上，将 染色质 免疫裂解 （ChIC） 确立为一种靶向方法，用于在定义的 基因组位点定位蛋白结合 （Schmid et al.， 2004），较新的方法现在能够从非常小的 细胞 数量进行全基因组分析。

在 2017 年，Henikoff 实验室引入了核酸酶靶向切割和释放 （CUT&RUN），这是一种新一代 染色质分析 方法，可提供高信噪比，测序深度最小（Skene 和 Henikoff， 2017；Skene 等人， 2018）。 CUT&RUN使用重组蛋白A/G-微球菌核酸酶 （pA/G-MNase）融合蛋白，该蛋白通过针对 目标蛋白的 抗体 募集到 染色质 （Meers等人， 2019）。 用 钙 活化 后，MNase 会切割结合蛋白附近的 DNA，将靶向片段释放到溶液中。 然后可以纯化这些片段并制备用于高通量测序，从而能够对 转录因子 占据率和 组蛋白修饰 模式进行全基因组分析。

CUT&RUN代表了ChIC的全基因组延伸，其使用类似的pA-MNase策略，但通常限于通过Southern印迹或其他靶向读数进行的基因座特异性分析（Schmid等人， 2004）。 对比度，CUT&RUN 的温和反应条件、低背景噪声和简单的 库制备 使其适用于需要高灵敏度的应用，包括低输入和稀有细胞 样品。

一种相关 方法， 染色质 内源裂解（ChEC），将MNase直接与 目标蛋白融合，以映射整个基因组的结合位点（Schmid等人， 2004；Zentner等人， 2015）。 尽管 ChEC 功能强大，但与 ChIC 和 CUT&RUN 等基于 抗体的方法相比，ChEC 需要生成带有 MNase 标签的蛋白，从而限制其通量和效用。

最近，Henikoff 实验室引入了靶向和标记切割 （CUT&Tag），该技术调整了 CUT&RUN 靶向策略，但用装载有测序接头的蛋白 A/G–Tn5 转座酶取代了 MNase。 在 抗体结合和 pA/G–Tn5 拴系后 镁 活化 镁激活会触发原位标记，同时切割 DNA 并在目标位点插入接头。 CUT&Tag 提供极低的背景，只需最少的纯化即可直接从反应中生成测序就绪文库，非常适合低输入、单细胞和高通量应用。

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ChIC/CUT&RUN 实验方案概述

1. 细胞核 准备 和 微珠 固定

分离的细胞核与 Concanavalin A 包被的磁珠结合，这些磁珠在整个洗涤步骤中支持高效处理和安全去除上清液。

2. 通透技术和抗体结合

将细胞核轻轻通透，并与识别 靶蛋白的 抗体 一起孵育。 该 抗体 可将随后的 酶解 活性定位到适当的 染色质 区域。

3. 蛋白 A/G-MNase 的招募

重组蛋白 A/G–MNase 融合蛋白与 一抗结合，将 MNase 精确系链到 染色质结合的靶标。

4. 钙依赖性裂解

添加 Ca2+ 后，MNase 变得活跃，并在 抗体-蛋白-DNA 复合体的两侧切割 DNA。 这释放短DNA片段，其从细胞核扩散到上清液中。

5. 片段回收和 库制备

收集、纯化解放的 DNA 片段，并进行标准末端修复、接头连接和 PCR 扩增，以生成测序就绪文库。

6. 全基因组分析

NGS 分析揭示 目标蛋白 在整个基因组中的分布。 在特定位点富集 测序读段 长可提供结合位点或 组蛋白修饰 景观的高分辨率覆盖区。

ChIC/CUT&RUN 实验方案示意图。 细胞核附着在磁性伴刀豆球蛋白 A 磁珠上，以便进行细胞处理并在每次洗涤后安全除去液体。 对细胞核进行通透处理，同时与靶向目标蛋白的抗体一起孵育。 蛋白 A/G-MNase 融合蛋白与靶向目标蛋白的抗体结合。 添加 Ca²  时，MNase 会裂解所形成复合物两侧的 DNA，并释放从细胞核扩散出来的 DNA 片段。 提取 DNA 并在基于末端修复和接头连接制备 DNA 文库时使用。 NGS 通过特定区域中序列的频率给出目标蛋白的结合信息。

ChIC/CUT&RUN 与 ChIP-Seq 的关系

切割和运行 被开发为 染色质 免疫沉淀的靶向替代方法，随后进行测序 （ChIP‐seq），解决了传统基于 ChIP 的工作流程的几个局限性。 虽然这两种方法都依赖于 抗体 来分离与特定蛋白质相关的DNA，但它们的生化策略不同，导致不同的性能特征。

For example, high‑quality CUT&RUN profiles typically require only ~3–8 million sequencing reads per sample, allowing researchers to multiplex more libraries per run and substantially reduce sequencing cost. In contrast, standard ChIP‑seq experiments often require 20–40 million reads per sample to overcome background noise and achieve comparable signal–to–noise, making CUT&RUN a more efficient and economical option for many applications. 测序深度降低、工作流程简化和输入要求降低使 CUT&RUN 成为许多实验室的有吸引力的快速选择。

但是，仍然存在 ChIP‐seq 可能是首选 方法的情况。 最常见的限制是 抗体可用性 和性能；并非所有 抗体 在天然 CUT&RUN 条件下都能很好地发挥作用。 此外，使用 ChIP-seq 中采用的交联条件，可以更有效地捕获某些蛋白质靶标，特别是具有非常瞬时 染色质 关联的蛋白靶标。

ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&TAG 的比较

表6：ChIC/CUT&RUN 与 ChIP-seq

在 CUT&RUN 中使用轻度交联

尽管 CUT&RUN 最初被设计为一种天然的非交联 方法，但许多实验室已经开始加入温和 福尔马林 交联，以提高脆弱蛋白-DNA 相互作用的保留率，或稳定在细胞核分离过程中容易丢失的蛋白复合物。 这种趋势尤其出现在涉及不稳定转录因子、辅因子复合物或无法承受广泛处理的 样本 类型的应用中。

在大多数工作流程中，交联是故意非常轻的，远低于 ChIP-seq 中常用的水平。 典型方法包括：

• 与 0.1–0.5% 短暂 孵育 福尔马林
• 固定 时间短（1–2 分钟）
• 在细胞核分离前立即淬灭

这些条件提供了足够的稳定性，以防止 染色质结合蛋白丢失，但保留了 CUT&RUN 的关键优势，包括低背景、高分辨率和小片段的有效回收。

但是，有重要的考虑因素：

• 过度固定 降低了可及性，限制了 MNase 拴系和切割效率。
• 轻度交联可能挽救困难靶标的信号，但也可能相对于完全原生的 CUT&RUN 增加背景。
• 方法 仍然比 ChIP-seq 更灵敏，输入更低，即使有光 固定。

每个新 靶蛋白通常需要方案优化（固定 持续时间、浓度和下游 通透 条件）。

常见问答

起始材料应该使用多少个细胞？

模式生物的基因组小于人/小鼠基因组时，是否需要增加细胞数量？ 建议每个样本不超过 500,000 个细胞。 一般来说，起始量为 50,000 个细胞比较好。 与 ChIP 不同，ChIC/CUT&RUN 非常敏感，所以不需要上百万个细胞作为起始材料。 细胞数量过多会降低收率，甚至降低文库的复杂性。

增加细胞用量时，是否应增加伴刀豆球蛋白 A 磁珠的用量？

每次实验使用的细胞数不应超过 500,000 个。 由于实验方案已对使用 50,000 至 500,000 个细胞时的磁珠数量进行了优化，因此不需要在实验方案建议的磁珠用量基础上另行增加。

如何冷冻保存细胞确保其可用于 ChIC/CUT&RUN？

建议在合适的缓冲液或培养基中添加 10% 二甲基亚砜 (DMSO)，然后使用 Mr. Frosty 异丙醇冻存盒缓慢冻存。 不建议快速冻存。

我有固定和冷冻染色质免疫沉淀 (ChIP) 细胞，可以将它们用于 ChIC/CUT&RUN 吗？

可以，但具体要看 ChIP 样本的固定和冷冻保存条件。 由于 ChIP 样本的细胞数可能会超过 ChIC/CUT&RUN 样本的推荐用量，并且使用强固定条件（如双重固定和淬灭）会损害微球菌核酸酶或 Tn5 的活性，所以标准实验方案可能不太适合。

您可以将样本分成多份，这样可以轻松避免 ChIP 样本中细胞数超过 ChIC/CUT&RUN 推荐起始量的问题。 但是，样本固定和冻存等问题仍然存在。 ChIP 实验方案的固定条件比较严格，很难与 ChIC/CUT&RUN 兼容，因为严格的固定条件很可能会损害微球菌核酸酶或 Tn5 片段化/标签化目标序列的能力，并且已有大量报道暗示了这种不兼容性。 另外，固定还有可能导致抗原表位被掩盖。 因此，不建议固定样本。 冷冻保存用于 ChIC/CUT&RUN 的细胞时，需要使用 10% DMSO 和 Mr.Frosty 异丙醇冻存盒缓慢冻存样本。 不建议在大多数 ChIP 实验方案中增加快速冻存步骤。

为什么洗涤过程中磁珠会结块？

结块可能是因为细胞与磁珠的比例过高或含洋地黄皂苷的缓冲液中的细胞核/细胞发生裂解，从而释放 DNA 并导致结块。 这种情况下，首先要检查细胞数量是否超过推荐数量。 此外，在与抗体一起孵育前，建议先用福尔马林轻微固定样本（室温下使用 0.1% 福尔马林固定 2 分钟），以减少磁珠在含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液中的结块。 但需记住的是，固定可能会影响表位的可用性，因此需要对每种抗体进行测试。

为什么用于一抗孵育的缓冲液中含 EDTA？

建议在透化和抗体孵育缓冲液中添加乙二胺四乙酸 (EDTA)，因为它会螯合 Mg² 离子，从而终止所有依赖三磷酸腺甙 (ATP) 的细胞过程（包括复制和染色质重塑），同时终止内源性脱氧核糖核酸酶。

哪里可以得到蛋白 A/G-微球菌核酸酶或蛋白 A-Tn5？

这两种融合蛋白最初都由 Henikoff 实验室提供。 现在已经有了制备融合蛋白的实验方案 (Kaya-Okur et al., 2019; Meers et al., 2019a)，而且质粒、蛋白 A-微球菌核酸酶、蛋白 A/G-微球菌核酸酶和蛋白 A-Tn5 都可以从试剂供应商处购买。

关于大肠杆菌 DNA 残留问题，大肠杆菌读段与样本读段的正常比例是多少？

残留与否取决于起始细胞的数量和抗体表位的丰度，起始细胞的数量与大肠杆菌 DNA 对应测序读段的数量呈负相关关系。 此外，残留与否还取决于伴刀豆球蛋白 A 磁珠的用量，磁珠用量越多，大肠杆菌的读段就越多。 总的来说，只能在细胞用量和磁珠用量相当的实验中才能使用大肠杆菌残留 DNA 进行校准。

作为参考，Henikoff 实验室报告的大肠杆菌读段在总读段中的占比范围在 0.01% 至 11.5%，其中免疫球蛋白 G (IgG) 样本的大肠杆菌读段数量通常较高（2% 至 11.5%）。 他们还报告称，在实验中只使用数百或数千个细胞时，大肠杆菌读段的占比可达到约 30% 至 70%。 此外，测试市售融合蛋白时，大肠杆菌读段在总读段中的占比仅为 0.01%，这一结果太低，不能用于数据归一化。

测序前是否可以采取什么办法控制实验质量？

与 ChIP 类似，可通过 qPCR 检查精心设计的目标区域。 但需牢记，必须在扩增文库上运行反应，不能在生成的 DNA 片段库上运行。 在 ChIC/CUT&RUN 中，释放的片段通常含有抗体导向 Mnase 尚未直接靶向的大基因组区域。 这些片段对通过这些样本制备的文库而言没有任何作用，但可以通过 qPCR 进行扩增。 为避免假阳性，应将 qPCR 模板作为扩增文库，同时添加合适的对照。

为什么转录因子实验的 Bioanalyzer/TapeStation 轨迹看起来像 IgG 对照？

好消息是，这很可能不是您的错！ 如果您的阳性对照样本（如 H3K27me3）返回了不错的核小体图谱，您只能通过样本测序才能知道您的转录因子样本是否起了作用。

而遗憾的是，转录因子文库看起来和 IgG 文库十分相似，这种情况十分普遍，但转录因子文库在测序后仍能产生优质数据集。 您可以选择采用 qPCR 法来比较 IgG 和转录因子文库中已知转录因子靶位点的信号。

参考文献和其他读数