流式细胞术中的自发荧光：概念解析与应对策略

自发荧光的成因有哪些？

• 细胞内在成分： 如 NADH、黄素（flavins）和卟啉（porphyrins）等分子受激发时会发出荧光。

• 细胞结构： 颗粒、线粒体及细胞外基质成分会产生背景信号。

• 样品制备： 固定（尤其是醛类固定）、透膜处理及某些缓冲液会增加自发荧光。

• 组织样本： 由于结构复杂并含有色素，实体组织的自发荧光高于 PBMC。

• 细胞激化：激活的细胞常因代谢变化而表现出更强的自发荧光。

自发荧光较强的细胞类型

• 单核细胞和巨噬细胞：富含颗粒和代谢辅因子。

• 树突状细胞：代谢活性高、颗粒度大。

• 上皮细胞： 含有结构蛋白和色素。

• 肿瘤细胞：常因代谢变化而表现出较强的自发荧光。

• 固定后的细胞： 醛类固定会增强自发荧光。

受自发荧光影响最大的染料

• FITC （绿色通道）： 因与 NADH 和黄素的发射光谱重叠，极易受到影响。

• PE（橙色通道）： 可能受细胞色素影响。

• Brilliant Violet 及紫外染料： 受影响较小，但在复杂样本中仍可能出现干扰。

• 低亮度染料： 弱荧光染料容易被自发荧光掩盖。

对激光的影响

• 紫外光（355 nm）和蓝光（488 nm）：此处自发荧光最强，会影响紫外染料（BUV 系列）和 FITC。

• 紫光（405 nm）：干扰程度中等。

• 红光/远红光（633 nm 及以上）：受影响最小，最适合用于关键标记物。

应对自发荧光的策略

1. 采用光谱流式细胞术

• 光谱解析（spectral unmixing）可对自发荧光特征进行建模并加以扣除。 设置未染色对照，作为自发荧光的参照。
• 设置未染色对照，作为自发荧光的参照。

2. 选择替代荧光染料

• 选用发射光谱处于自发荧光范围之外的染料（例如 APC 或 Alexa Fluor 700 等远红光或红外染料）。

3. 样品制备

• 尽量减少固定，或使用可降低自发荧光的固定剂。
• 充分洗涤样本，以去除残留试剂。

4. 设置适当的对照

• 未染色对照是识别自发荧光的关键。
• FMO 对照有助于区分真实信号与背景信号。

5. 制定合理的门控策略

• 当自发荧光使门控复杂化时，可借助其他标记物来确认细胞群的身份。

自发荧光疑难解答

问题 1：背景信号高

• 原因：自发荧光较强的细胞类型或组织样本
• 解决方法：使用远红光染料，设置未染色对照，可考虑采用光谱流式细胞术

问题 2：弱表达标记物分辨率不佳

• 原因：弱荧光染料被自发荧光掩盖
• 解决方法：为低表达标记物分配明亮染料（PE，BV421）；关键标记物避免使用 FITC

问题 3：组织样本中的自发荧光

• 原因：醛类固定剂会增强自发荧光
• 解决方法：缩短固定时间，充分洗涤，关键标记物使用远红光染料

问题 4：组织样本中的自发荧光

• 原因：实体组织中的结构蛋白和色素
• 解决方法：采用光谱流式细胞术，选择自发荧光范围之外的染料，设置未染色组织对照

问题 5：自发荧光干扰活性染料

• 原因：与活力染料的发射光谱重叠
• 解决方法：选择远红光通道的活力染料；用 FMO 对照验证门控

补充提示

若条件允许，光谱解析（spectral unmixing）是应对自发荧光最有效的方法。 请始终设置未染色对照，作为自发荧光的参照。