二抗选择指南

​​一抗的宿主物种

二抗的宿主物种应不同于一抗，例如，如果您使用来源于兔的一抗，那么应使用来源于除兔以外其它宿主物种的抗兔二抗（例如驴抗兔二抗）。

实验流程

二抗通常是偶联形式的抗体。ELISA 或蛋白质印迹实验等应用最常用的是酶联二抗，而在流式细胞术实验或免疫荧光实验中，优选与荧光蛋白或染料（例如 Alexa Fluor^®）偶联的二抗。

抗体分类/亚类

二抗必须配对一抗的同型。

多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，并且是 IgG 同型。因此，二抗通常为抗 IgG H&L（重链和轻链）抗体。

单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果单克隆一抗为小鼠 IgG1，则需要抗小鼠 IgG 二抗，或者特异性较低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG 二抗。

人免疫球蛋白分类、亚类、分型和亚型：

• 分类或同型：IgG（γ 重链）、IgM (μ)、IgA (α)、IgE (ε)、IgD (δ)
• 亚类：IgG1（γ1 重链）、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、IgG4 (γ4)；IgA1 (α1)、IgA2 (α2)
• 分型：κ 轻链、λ 轻链
• 亚型：λ1、λ2、λ3、λ4

​​其它类型的反应：

• 多价抗体可与所有免疫球蛋白反应
• 抗 Fc 或重链 (α、δ、ε、γ、μ) 抗体仅与重链反应
• 抗 F(ab) 或完整分子抗体与重链和轻链反应，而与免疫球蛋白的种类无关
• 由于同种属所有亚型的免疫球蛋白均具有相同的 κ 和 λ 轻链，因此抗轻链（κ 和 λ）抗体可与同种属所有亚型的免疫球蛋白反应

预吸附二抗 — 消除种属反应的理想选择

预吸附二抗是同时使用多种一抗及其相应的二抗进行多色实验的理想选择。预吸附处理可降低二抗与细胞和组织样品中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应的风险。

预吸附（又称交叉吸附）是为提高抗体特异性而引入的额外步骤，具体方法是利用具有潜在交叉反应性的物种（本例中为绵羊和牛的轻链）制备固定血清蛋白，然后使二抗混合物（例如含有抗兔 IgG 轻链、抗绵羊 IgG 轻链和抗牛 IgG 轻链的二抗）通过含有这种固定血清蛋白的基质。

只有特异于兔 IgG 轻链的抗体能够通过柱子，而与绵羊或牛 IgG 轻链发生交叉反应的抗体将结合并吸附到基质中，从而得到可特异性地识别兔 IgG 轻链的二抗。

F(ab) 或 (Fab')2 片段二抗

F(ab) 和 (Fab')2 片段二抗可避免抗体的 Fc 部分与细胞（例如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、NK 细胞和 B 细胞）上的 Fc 受体之间发生非特异性结合，而且这种抗体尺寸较小，能够更有效地渗入组织。

由于片段抗体没有 Fc 部分，因此它们不会干扰抗 Fc 介导的抗体检测。