生命科学研究用共聚焦显微术的原理与实践网络研讨会

和 Ann Wheeler 博士一起探讨共聚焦显微术的基本原理。

共聚焦显微术最实用概要:样品制备到数据分析、常见错误和问题、优化仪器设置、采用共聚焦显微术的高级应用。 

本网络研讨会适用于有兴趣使用或正在使用共聚焦显微术,以及希望更好地了解这项技术及其在实验中的应用的用户。

Watch webinar

网络研讨会主题:

  • 共聚焦显微术样品制备

  • 何时使用共聚焦显微镜

  • 与落射荧光显微术相比的优势

  • 共聚焦显微镜的工作原理

  • 共聚焦显微术常见问题

  • 高级应用


主讲人简介

Ann Wheeler 博士来自英国伦敦玛丽女王大学布利泽德 (Blizard) 细胞与分子科学研究所的核心成像实验室。

网络研讨会文字记录

女士们先生们,大家好,感谢大家的支持,欢迎参加今天的 Abcam 网络研讨会:生命科学研究用共聚焦显微术的原理与实践。今天的第一位发言人是高级活动协调员 Lucy Purser。现在,让我们欢迎 Purser 女士。

LP:       谢谢 Nathan。大家好,欢迎参加 Abcam 的共聚焦显微术网络研讨会。今天的主讲人是 Ann Wheeler 博士,她来自英国伦敦玛丽女王大学布利泽德细胞与分子科学研究所的核心成像实验室。Ann 的博士研究是在伦敦路德维希癌症研究所进行的,她在 Anne Ridley 教授的指导下于 2005 年获得博士学位。她的博士后研究先是在加州拉荷亚的斯克里普斯研究所进行。

回到英国后,Ann 进入了伦敦帝国理工学院。在帝国理工学院,她与癌症研究所合作进行 siRNA 筛选项目,该项目旨在鉴定和表征参与调节细胞间粘附的肌动蛋白细胞骨架动力学的新型蛋白。自 2009 年起,Ann 一直担任布利泽德医学研究所核心成像实验室的主任。她曾在几家一流期刊上发表过文章,并因显微术研究荣获奖项。

今天,与 Ann 一起为我们带来研讨会的还有 Abcam 产品经理 Miriam。Miriam 在巴塞罗那大学获得生物学学士学位,并在阿姆斯特丹自由大学获得博士学位,之后她加入了剑桥大学 MRC 分子生物学实验室。Miriam 于 2008 年加入 Abcam。

如 Nathan 所说,我们开讲之前,先简单提醒一下,大家可通过您电脑屏幕右下侧的问答面板随时提交问题,这些问题会在研讨会结束时进行解答。另外,当您退出网络研讨会时,界面会跳转至一个页面,该页面提供有讲义的 PDF 版本供大家下载。现在,就有请 Ann 开始今天的研讨会。

AW:      谢谢 Lucy。你真好,如此有爱地介绍我。今天我们来谈谈共聚焦显微术,并讨论如何在大家的研究中充分利用这一技术。共聚焦显微术作为一项技术可以获得细胞、组织及其他可用作生物样本的高分辨率荧光图像,并通过消除非聚焦平面来实现这一功能。

那么,进行共聚焦显微术实验需要准备什么呢?我想你们中大部分人已经有了答案,因为你们在研究中就是这样做的。共聚焦显微术有着广泛的应用,这里只总结了其中一部分,可以进行共聚焦实验的方法还有很多。

您可以使用共聚焦显微术定位或共定位不同的蛋白,并观察它们是如何相互作用的。共聚焦显微术可用于两种、三种甚至四种荧光染料的成像,并观察抗原表位与蛋白之间的相互作用。它可以用来生成样品的 3D 图像,这样您就可以在真实的空间里查看结果,并观察分子在整个空间或整个生物体中是如何分布的。共聚焦显微术还可用于半定量测量,因此您可以用它来定量蛋白的表达,或者在诱导蛋白突变或用 siRNA、药物或其他抑制剂干扰蛋白时进行蛋白质比较研究。并且,大多数人倾向于使用共聚焦显微镜术来获得高质量的图像,以用于演示。所以,这项技术真的可以用来产生非常有冲击力的图像,帮助您发表数据,或在展示图像时吸引别人来观看您的海报。

那么,什么时候需要使用共聚焦显微术呢?共聚焦显微镜的工作范围有限,它可用于荧光标记的 200 nm 至 1 cm 左右大小的结构的可视化。这意味着它可以用于标准细胞生物学、组织生物学及单分子成像。

接下来,我将简单概括一下我今天要介绍的部分内容,以及我希望大家通过本次网络研讨会了解的内容。首先,我们将讨论共聚焦显微镜的工作原理,它的内部结构是什么,为什么它会产生完全聚焦的高分辨率图像。然后,我要介绍的是共聚焦显微镜是如何产生多色图像的,如果您在设置时没有留意的话,可能会出现一些问题。我还将介绍 Z stack 采集,以及共聚焦显微术中的 3D 成像和开始设置前需要考虑的事项。最后,我将介绍一些我作为核心实验室主任经常会听到的问题,一般来说,人们在尝试进行共聚焦成像时都会出现这样的问题。我们在研讨会结束时会有问答环节,欢迎各位随时提出问题。

那么首先,荧光显微术和共聚焦显微术有什么区别?为什么我们要进行共聚焦显微术实验?我希望这张幻灯片能说明这个问题,正如各位所看到的,我们展示了一个细胞内部结构的例子。大家可以看到,在宽场荧光图像中,这看起来非常干净而且非常黄,我们无法看到更多细节。但是,我们在共聚焦图像中可以看到许多结构。您也许会说这两处的染色是相同的,但实际上,使用共聚焦方法可以去除一开始看到的非聚焦光,而且,我们可以看到很多不同的结构。这里还有黑色的 STED 空间,所以样品可能没有按照预期的方式被染色。

这是一张细胞间连接蛋白的图像,从图像中您可能会觉得它们分布非常广泛,但实际上,当您用共聚焦显微镜观察时,您可以看到它是相当离散的。因此,共聚焦显微镜实际上可以用来去除一些伪影。

也许最能说明为什么需要使用共聚焦显微镜而不是荧光显微镜的图像,是这张花粉粒的图像。在宽场荧光显微镜下,由于非聚焦平面和围绕花粉粒中心的上下两侧的膜,整个物体看起来都是红色的。实际上,在共聚焦显微镜下,您可以看到中间的部分,并可以清楚看到里面有一个被不同抗体染色的结构。从多方面来看,这就是为什么许多人在获得成像时将共聚焦显微镜作为首选工具的原因。

那么共聚焦图像为什么会如此清晰,或者说共聚焦显微镜为什么如此复杂?实际上,实验室中的很多人都要经过一些相当严格的培训,然后才能使用共聚焦显微镜。原因我们马上就介绍。宽场荧光显微镜看起来像一个非常复杂的工具,但实际上这里面是很简单的。

显微镜中有一个高压汞弧灯,其发射光谱非常广,所以它可以发射不同波长的光,范围从近紫外波段的 350 nm 左右一直到 800 nm。用于照射您样品的光包括非聚焦光和聚焦光,这些光由双色向分色镜反射后经由物镜打到样品上。样品显然很厚,并不薄,一般来说样品不会是一个原子的厚度。如果是一个细胞,那么会有几微米厚,所以光随后会由样品发射出来,并在您感兴趣的点处出现聚焦光,但周围也会有非聚焦光。这会通过物镜回到分色镜并被相机捕捉到。因此,相机中的图像包含了样品发射的聚焦光和非聚焦光,这就是您在前一张幻灯片中看到的图像非常朦胧的原因。

那么共聚焦显微镜的工作原理又是什么?实际上,这是由一位名叫 Minsky 的小伙在上世纪 50 年代设计的,这是一项真正的突破。他所设计的结构就是,如果您使用这些叫做针孔的东西(针孔基本上是一种小金属片设备,在其前侧有可调节尺寸的小孔),那么您可以用它来遮挡非聚焦光。设备中没有汞灯泡而是使用激光,这是因为存在许多聚焦光和非聚焦光,但与非聚焦光相比,聚焦光只有一小部分。所以当您开始进行样品成像时,您需要使用高强度的光源。这通常是由特定波长的激光器发出的,激光通过针孔照过来,同时通过双色向分色镜反射到您的样品上。当然,现在即使是进入的激光也是聚焦的。当光照射到样品时会产生容积激发,样品发出的光将包含聚焦光和非聚焦光。这将光通过物镜反射回来,可能会在图像中造成更多像差,并且进入检测器。

现在,位于检测器前面的部分才是共聚焦显微镜真正发挥作用的地方。这里有个针孔,针孔到检测器以及物镜的距离都已经经过严格计算。因此,它处于样品的共轭平面上,这是一个聚焦平面,所以这个针孔是在共聚焦平面上,也就是在聚焦平面的相反一侧。现在,如果您知道您的样本将发射的光的波长,您就知道该观察什么。您也能知道聚焦光的波长有多长,并且知道波长的距离,这样您就可以设置好针孔的长度或尺寸。这意味着针孔会切断样品发射的非聚焦光,而只保留聚焦光;这很好,因为您只需要聚焦光。但是,同样地,与起初的光源类似,这意味着大多数光线实际上被针孔去除了,而只有少量的聚焦光可以到达检测器。因此,检测器需要比普通相机更灵敏。一般来说,人们使用的是光电倍增管,当光线进入时,它会逐点采集样品,然后把结果反馈给计算机,计算机会构建出图像。

那么总的来说,针孔有什么作用呢?它的主要目的是去除非聚焦光。针孔是可调节的,这很重要,因为针孔的大小显然取决于您所使用的物镜和光的波长。如果您使用的是短波长的光,那么针孔需要足够小,因为波长很短。如果您使用的是波长较长的光,比如红色染料,那么需要调大针孔,因为波长更长。为了便于使用,一位很有贡献的光学物理学家决定用 Airy 装置来测量针孔大小,而不用我们自己进行数学计算。

所以在共聚焦显微镜上的针孔是已经测量过的,这意味着只存在聚焦光,一般的共聚焦显微镜会知道您所使用的物镜型号和光的波长,您只需要在设置时输入这些内容即可。因此,共聚焦显微镜能够计算出您需要设置的针孔尺寸,您也可以在选择时进行调整。

下面我来介绍一下,为什么需要激光器以及强光源。这是因为您已经滤除了所有的非聚焦光,只剩下聚焦光,聚焦光的量并不多。所以同样的,检测器也只能接收到聚焦光。所以您需要一个更为敏感的检测器,通常是光电倍增管,但有时也可以使用 EMCCD 相机。

那么共聚焦显微镜实际上是如何采集图像的?它是怎么实现的呢?共聚焦显微镜不只是发出光,光最后再进入检测器,这个过程要复杂的多。有过共聚焦显微镜使用经验的人都知道,与宽场图像相比,采集一幅共聚焦图像需要花费一点时间。这是共聚焦的采集过程,所以基本上在共聚焦显微术中,您只需要选择样品并将其聚焦,仪器会在您的样品上放置一个虚拟栅格,栅格中的每个单元格称为像素。您可以自己决定使用多少像素。共聚焦显微镜会默认某种像素大小,实际上您也可以自己选择,也就是说您可以选择适合自己的像素大小。接下来,共聚焦显微镜将逐像素扫描您的样品,如图中底侧的红光所示,这是正在逐个像素扫描样品的激光。仪器会收集给定像素的聚焦激光,然后送到检测器中并构建图像。

那么共聚焦显微镜实际上是如何采集图像的?它是怎么实现的呢?共聚焦显微镜不只是发出光,光最后再进入检测器,这个过程要复杂的多。有过共聚焦显微镜使用经验的人都知道,与宽场图像相比,采集一幅共聚焦图像需要花费一点时间。这是共聚焦的采集过程,所以基本上在共聚焦显微术中,您只需要选择样品并将其聚焦,仪器会在您的样品上放置一个虚拟栅格,栅格中的每个单元格称为像素。您可以自己决定使用多少像素。共聚焦显微镜会默认某种像素大小,实际上您也可以自己选择,也就是说您可以选择适合自己的像素大小。接下来,共聚焦显微镜将逐像素扫描您的样品,如图中底侧的红光所示,这是正在逐个像素扫描样品的激光。仪器会收集给定像素的聚焦激光,然后送到检测器中并构建图像。

因此,在进行共聚焦显微术实验时,您需要考虑的一个更重要的问题是如何制备样品。使用明亮的光十分重要,我们用量子产率这个技术术语来对描述它。量子产率是指荧光染料释放的光子量与荧光染料吸收的光子量的比值。所以如果有大量光子从染料中释放,它的量子产率就会很高并且对于使用共聚焦显微镜来说十分理想,比如 Alexa Fluor® 染料就是非常不错的。

基本上,如果您想改善您的共聚焦图像质量,那么您可以采取以下几种措施。一般来说,当您开始使用共聚焦显微镜进行成像时,它将默认设置为快速扫描模式,以优化激光功率和检测器灵敏度。但是,激光点扫描的速度是可以调节的,扫描激光的速度越慢,得到的噪音就越小,因为很显然激光在单个像素上停留的时间更长一些。然而,很明显,如果您把激光停留在某个点上,就像我的激光笔指示的这样,如果您将激光放置太久,最终会烧出一个洞来。所以需要有所权衡,您可能需要将激光扫描放慢一点,但放慢太久就会漂白您的样品。也可以用激光多次扫描图像中的单个像素,然后求其平均值。取平均值也可以降低噪声并增强信号。因此通过减慢激光速度和增加像素扫描次数并取平均,您可以增强信号并降低噪声。这会得到一个非常漂亮的图像,就像图中这样。

那么,如何优化图像采集呢?首先,您要做的第一件事是检查您的图像是否饱和或欠采样,在左手边这里,我正在展示的就是饱和图像或欠采样图像。一般来说,您需要点击共聚焦软件上的一些按钮来显示像素是否饱和和欠采样。每台共聚焦显微镜都有所不同,每个制造商也都有单独的软件,因此您需要联系您的共聚焦显微镜制造商或请教拥有丰富的共聚焦显微镜使用经验的人来找到这些按钮。一般来说,饱和像素显示为红色,欠采样像素显示为蓝色,最好的情况就是图像中既没有饱和像素也没有欠采样像素,这样您才能真正展示所有的数据。所以即使背景是黑色的,或者说,肉眼看起来是黑色的,那么只要不是因为欠采样而呈现出黑色,就是真实的图像。您并没有将这些数据排除,同样的,如果您有一些发射光非常强烈的结构,可能的话,您需要在检测器范围内进行检测。那样您所展示的才是完整的数据集,没有任何数据遗漏,这才是最佳科学实践。

务必确保您的样品没有被共聚焦显微镜漂白,这种情况很容易发生。最好的办法是在保证可以成功成像的条件下将激光功率尽可能调低,但这可能仍然相当高,具体取决于您的样品。然而您需要尽可能调低激光功率,以免漂白样品。检测器应拥有适当的灵敏度,使样本既不会过采样也不会欠采样,让其完全处于检测器的线性范围内。在我看来,背景也应该处于检测器的线性范围内,并且应该呈现黑色。

现在我们来讨论研讨会的下一部分,也就是多色共聚焦成像样品的制备。正如这里所看到的,我们得到了一些组织神经细胞和多种小细胞的出色图像,为确保多色成像,这些细胞已被标记上美丽的色彩,并且任何人都有可能获得这种质量的图像。

因此,当您设置多色图像共聚焦扫描时,首先您需要了解您所使用的染料的特性。所以您需要了解染料的激发或吸收光谱,以及发射光谱。通过这个信息,您可以知道需要使用哪种激光来激发它,并且应在恰当的位置设置哪种检测器或滤光片来检测染料。

目前,市售的普通共聚焦显微镜一般都有预先设定好的常用染料组合。人们通常会采用 DAPI、蓝色、绿色以及红色的染料进行成像,这些都有预先设定的组合。充分了解所使用的染料十分重要,我稍后会讨论这个问题。一般来说,当共聚焦显微镜扫描多色图像时,您可以将其设置为分别显示每个通道,然后再是合并的通道。这很重要,因为您需要为每个正在成像的通道校准检测器,而不仅仅是合并通道。所以我们需要确保在最佳实践中获取数据时,绿色、红色和蓝色染料都在共聚焦显微镜检测器的线性范围内。

如果信号来自不同的通道,在合并图像中同一个像素会发生什么呢?如果您还记得,那就是共聚焦显微镜会将图像分成一个个像素。因此,如果样本中有信号来自同一像素的两个不同通道,它会显示为这里展示的黄色。

在介绍后面的内容之前我先来大致介绍一下荧光理论,我认为这很有必要,基本上荧光理论就是这样的。激光照射进来,此时的染料处于基态。激发激光进来以后,染料吸收一部分光并跃迁至高能量的激发态,但是荧光染料被固定住了。所以它不能自行回到基态,它必须找到一种释放能量的方式。因此染料会振动,它会撞到周围的分子并释放一部分能量和热量,然后回落到低一些的能量状态,最后回到基态。激发所需要的能量和吸收后所释放的能量是有区别的。激发它的光子将是高能光子,染料会释放部分能量,然后发射低能光子。这就是说当您在做成像实验的时候,您会选择一种颜色的光来激发您的样品,然后当您通过目镜观察时您会看到另一种颜色的光,这就是其中的原因。

以上就是激发光谱和您需要观察的发射光谱相关内容。在我所工作的实验室中,通常会遇到一个问题,这些都是什么?基本上,染料不会只在一个波长处被激发,它会在某个波长范围内被激发。这是 Alexa Fluor 488®,正如各位看到的,它在 488 nm 附近有最大激发。而在 450 nm 处也会有轻微激发,同样在 520 nm 也有。但是,如果您用 488 nm 的激光照射,则会有 75% 左右的分子被激发。同样,正如您看到的 Alexa Fluor® 568 这种染料,当用 568 nm 的激光照射时,会有 60% 左右的染料将在该波长处被激发。

比较两个不同波长之间的激发光谱十分有用,如果您先用 488 nm 的激光激发染料,再用 568 nm 的白色激光进行激发,那么您会发现 568 nm 的白色激光不会激发 488 染料,这点很重要。您需要将此区分开来,目前也有一些在线工具可以帮助大家进行区分。

我们来进一步看下发射光谱的问题,这是染料回到低能量水平时发射的波长范围,之后染料会回到基态。可以看到,用 488 nm 的激光激发染料时在 500-650 nm 范围内都有发射,但是到了 550 nm 时大部分发射光就已经观察不到了。同样,对于 568 染料,大部分发射光都出现在 600 nm 附近,但 550 nm 处仍有少量发射,甚至在 700 nm 处也出现了发射光,只是不是特别多。

这什么意思呢?这说明 488 和 568 染料的发射光谱有所重叠。也就是说,当您设置显微镜时,如果没有留意,您可能就会在 488 染料的通道中获得一些 568 染料的信号。理论上看起来有点复杂,但在下一张幻灯片中我会向大家展示实例。

这是一组展示,所以这是 Alexa Fluor® 488 染料,这是 Alexa Fluor® 568 染料。这个展示是说,他们没有注意采集光的设置,所以一些来自 488 的光实际上已经进入 568 中。那么你在这个通道中看到的就是这种蛋白质到处都是。然而,事实上,如果你更小心地设置它,那么你可以从 568 中特异性地分离出 488,你会看到 488 确实位于细胞中央。但如果你仅采集 Alexa Fluor® 568 的光图像,你会发现这种蛋白仅存在于细胞与细胞间的边界,并最终在细胞中间。

因此,不管理串色问题确实会导致对数据的误解,这是相当严重的事情。所以非常重要的一点是,你要了解如何设置仪器上的滤光片或者检测器来精确地挑选你要测量的波长范围,而不能选择更多。

那么,共聚焦是如何帮助这种光谱重叠的呢?好的,其中一种方法是顺序扫描,通过这样做,共聚焦会被设置为收集每个通道,这是分开进行的,所以它会先收集绿色通道,然后收集红色通道。这通常只相隔飞秒级的时间,这是非常非常快的,所以你不必在那里坐几分钟。然后,当你进行顺序扫描时,你可以选择扫描整个图像或者逐行扫描像素,这样你就可以看到整个物体或者看到逐行构建起的两个通道。使用同歩扫描来获取图像是可行的,也就是说,共聚焦显微镜上所有的激光器都在同时扫描。

与此有关的问题是显然会发生串色,但优势是它快得多,这只是取决于你想做什么。一种折衷方案是使用混合扫描,这意味着当你知道通道之间没有光谱重叠时,你可以使用两个激光器进行扫描并使用两个检测器进行检测。所以,人们常用的一种组合就是 Alexa Fluor® 488 染料,这种染料是由 488 nm 光激发,然后再用 Alexa Fluor® 633 或 Alexa Fluor® 647。这两种染料完全不会相互作用,所以很容易同时检测到这两种染料而不发生任何串色。

所以这只是一个例子,说明顺序扫描和同步扫描的区别是什么,我只是要重复这一点。你扫描图像的方式会产生截然不同的结果,在开始之前检查一下你是怎么做的是很重要的。所以,这张是仅用 Alexa Fluor® 488 染料的图像,这张是仅用 Cy3 的图像,如果你进行顺序扫描,你可以看到这两者的结合会让你的细胞分离。然而,如果你进行同时扫描,它们就会发生重叠,所以在 D 图的合并图像中,它可能看起来像信号是共定位的,但这真的是错误的共聚焦设置产生的假象。因此,如果你正在研究蛋白质的共定位,你必须设置顺序扫描来呈现数据的解释。

同样,当你准备样品进行共聚焦时,特别是当你进行共定位时,你需要确保每个表位被分开标记,并且激发光谱和发射光谱的图谱要分的很开。共聚焦显微镜有针对染料的滤光片,所以它们可以在光路中被特异性地分开。

如果你想真正确定并且严格对待你的实验方式,你也应该包括一些对照。所以你需要为荧光成像设置一些阳性对照,如果你不确定抗体是否生效,也许需要采用一种确定有效的抗体或染料。

你需要包括一些染色的阴性对照;成像的人往往只是自己使用第二种染料,以确定用于二抗的染料是否会混杂地结合在不应该的位置。

许多生物样品会有自发荧光,尤其是含很多 NADH 的脑组织,这些黄素的荧光很强。所以包含一个未染色的样品十分有用,实际上你可以设置检测器,这样就不会收集到任何自发荧光背景。

我还建议为光谱串色设置对照,那么只需标记一个抗原表位,就可以在两个通道中使用共聚焦进行收集。所以说,例如,你正在期待进行实验,查看绿色通道和红色通道之间的共定位,那么你需要有一个对照,仅获取在绿色通道中发光的 Alexa Fluor® 488,然后成像,再检查红色通道的结果。如果在红色通道中出现结果,你就知道仪器设置的方式有问题,因此您需要更改红色通道检测的参数,因此仅使用绿色通道是不会在红色通道中看到任何结果的。你还需要用另一种方法来进行这个实验,也就是单独使用红色通道,并且确保在绿色通道中没有看到任何东西。

如果结果中有意料之外的内容,人们有时也会包括同型对照以确保染色的特异性。我强烈建议大家要确保样品是通过顺序扫描收集的。

现在我要把时间交给 Miriam,她要给你们做一个小测验。

MF:        如 Ann 所说,现在是测试时间,让我们来看看你的荧光染料知识了解得有多好。测验将出现在屏幕右下角,你有一分钟时间来回答这三个问题。所以这是前两个问题,这是第三个问题。非常感谢您的参与,答案将在问答环节之前揭晓。我把话筒交给 Ann,她将带大家进行网络研讨会的第二部分,非常鼓励大家提交更多与显微镜相关的问题。

AW:       非常感谢你,Miriam,很好,很有帮助。所以现在我们需要多谈一些关于在共聚焦显微镜上采集那些非常美丽的三维图像的问题。从这个例子中你可以看到一个发育中的斑马鱼胚胎,你可以通过大量的细节对整个生物体进行取样,然后你就能旋转它们,并且实际上真的能看到样本内部的结构。

然而,在建立 3D 成像之前,需要考虑几个因素。所以如果我们回到会议开始所讨论的理论,共聚焦针孔将从 X 和 Y 平面移除离焦光,所以这只是一个平面。事实上,这个过程要比这个稍微复杂一点,它去掉了轴平面或 Z 平面上的离焦光,我会在这次讨论中简单提到这个。你可以在这里看到,这是一个聚焦光的例子,它有 x、y 和 z 分量。针孔移除了所有的离焦光,这意味着可以使用共焦显微镜来提供载物台移动,以在不存在任何离焦光的情况下对物体的整个体积进行 3D 成像。

我现在要介绍的,按照常用术语来说,叫做获得共聚焦 X、Y 和 Z切面,也被称为光学切面。所以光学切面并不像一张薄纸那样完全平坦,它的形状实际上更像一个立方体。光学切面的厚度由三个因素决定:物镜的数值孔径,即通过它后留下多少光线;共聚焦针孔大小,即聚焦光有多少;还有光的波长。物镜的数值孔径是描述物镜在固定距离从样本中采集光的效果。每一个物镜都会有数值孔径,所以这是通用的物镜。

你可以看到放大倍数的描述。这是数值孔径,数值越高物镜就越容易聚光。你需要弄清楚物镜的数值孔径,以便在开始 3D 成像实验之前,了解它采集光学切面的效果。

因此,为了采集共聚焦体积,你需要尽可能多地了解关于成像的信息。所以光学断层在 x、y 和 z 轴上必须是理想的,所以你需要找出适用于物镜的光学切面的厚度。然后你需要将载物台移动的增量设置成与光学切面几乎相同,以采集此处所有的光,这样你就可以产生真正代表原物的 3D 图像。这些信息你可能不知道,但显微镜制造商可能会告诉你。

举个例子,我得到了一些关于物镜、数值孔径和光学切片厚度的信息,假设包括针孔。所以你可以看到一个数值孔径为 0.3 的 10X 物镜,这是相当低的数值,光学切片实际上很宽,有 11 µM。所以,很明显,如果你的样品很薄,那么你可能甚至不需要做 Z stack,而你的切片中所呈现的就你所需要的关于样本的所有信息。如果你采用更高倍数的物镜,比如数值孔径更高,那么你可以看到光学切片的尺寸就会下降。所以当你使用 63x 的油镜时,如果你的数值孔径很高,比如说 1.4,那么光学切片的厚度为 0.3 µM。所以,当然,这取决于样本的大小,如果样本像斑马鱼一样大,你可能需要相当多的切片来采集所有样品中的聚焦光来渲染 3D 体积。

因此,我建议人们设置共聚焦体积成像的方法是,让显微镜从样品顶部开始收集 Z 切片,而这时应该没有聚焦光。因此,样品应该只在顶部是离焦的,然后它应该一直向下移动到底部,底部也没有聚焦光。如果你要尝试收集完美的 3D 切面,你需要扫描经优化的光学切片,这可能需要一些时间。

所以,这确实是采集 3D 切面的理想方式。现在,我将继续讨论我在核心实验室时人们刚开始使用共聚焦显微镜时经常被问到的一些问题。以前从未做过共聚焦实验的人问我的第一个问题就是,当我通过显微镜向下看,而仪器被设置为共聚焦扫描时,我什么也看不见。这很好解释,因为激光强度非常大,如果你盯着它看会损害你的眼睛。所以,如果你需要在显微镜下看到你的样品,你需要确保光设置为眼睛观看模式。如果在这样的设置下你还是什么也看不见,那么很可能是你的样本染色没有起作用。当你把光设置为共聚焦模式时,如果你看不到任何东西,那么这是一件好事,因为这意味着激光实际上不会进入你的眼睛,如果你能看到一些内容,那么你需要立即联系你的显微镜制造商。

第二个问题是:我在成像时样本逐渐消失了。这与共聚焦的激光器被设置为非常高的功率有关,所以它们有时会漂白你所使用的染料。所以最好要避免这种现象,一旦你的样品被漂白了,你就什么都不能做了,染色已经消失了,但也许在同一张切片的不同地方你可能还有机会获得一些图像。此时要做的事就是确保检测器设置为最大灵敏度,激光器处于尽可能低的功率,这样你就可以减少样品中的漂白。

人们通常还会关心的就是他们的样品看起来很暗淡。现在,如果你的样本通过肉眼看真的很暗淡,那么染色就太弱了,需要优化共聚焦设置。因此,你可能需要将检测器的灵敏度调到最大,并且使用功率更强的激光器,甚至可能得到任何类型的图像。虽然你确实需要记住,你需要公平地展示数据,所以在切片上产生一些模糊的东西可能是正确的做法。

如果染色肉眼看起来很明亮,那你需要承认,检测器的灵敏度有待提高,因为这或许是上一个用户离开时留下的,虽然他们的染色很好,但你的染色和他们的不一样,所以你需要重新优化仪器。但我要重申的一点是,获取样本的代表性图像是非常重要的。

如果你在使用共聚焦时你的样品看起来很粗糙,这可能是由于共聚焦尚处于初期的快速扫描模式,这是用于优化检测器并确保一切都在检测器的线性范围内,所以这并不是饱和的或欠采样的。你可以做的是,实际上可以选择减慢共聚焦显微镜扫描速度,并增加平均帧数。这意味着,通过放慢速度并让激光在每个像素上停留地久一些,大约平均两帧或四帧,你就会减少这些粒状的造成,得到一个漂亮的图像。

最后一个问题很棘手。你认为你在样品中看到了共定位,但你的导师、PI 或团队领导、博士后或其他人却不同意你的观点。所以,如果你只展示一个共定位图像,那么不足以做出强有力的科学案例。当你展示共定位数据时,你需要展示染色时的所有对照,并且需要确保使用与对照组设置相同的同一台共聚焦显微镜来捕捉图像。所以你需要有一张仅显示绿色通道的图像,而红色通道中没有任何东西,以及仅有红色通道而绿色通道中没有任何东西的图像。使用顺序扫描来设置仪器也是非常重要的。

我在本次网络研讨会上所介绍的理论部分就结束了,我再来总结一下我所介绍的内容。共聚焦显微镜可以消除离焦光,并产生高质量的图像。共聚焦显微镜主要通过点扫描工作,它们将逐点扫描每一幅图像,并且共聚焦的速度和平均值可进行改变以改善图像质量。顺序扫描对于防止一种染料串色到另一个通道是很重要的,当你进行共定位实验时,这是非常重要的。共聚焦可以用来重建三维体积,但是在设置三维体积时,非常重要的是要了解你的光学切片的厚度,以及针孔处的物镜及其数值孔径的更多信息。

现在我要把时间交给 Miriam,请她来为大家总结可提供的产品和服务。

MF:        非常感谢 Ann 带来信息丰富又如此详细的研讨会。大家好,我愿借此机会给大家讲讲 Abcam 的显微镜资源和产品,帮助大家改进细胞成像实验。兔单抗或 RabMAb 赋予高亲和力和高特异性,使染色的灵敏度高且背景低。在苛刻的应用场合,如福尔马林固定组织或石蜡包埋组织的 IHC 试验,兔单克隆抗体就成为理想的亲和试剂。为了让你获得最佳体验,每种兔单克隆抗体均已经过人组织芯片 IHC 实验或多样本 ICC/IF 实验的验证。RabMAb 也赋予了对人蛋白靶标和小鼠直系同源基因的多种表位识别,所以不必生成单独的替代抗体。由于 RabMAb 都来自兔源,它们适用于小鼠或大鼠的组织样本。RabMAb 也易于与小鼠或大鼠单抗配对,进行同步染色。想了解更多信息,请访问 abcam.com/RabMAbs。

要用 RabMABs 染色,我们推荐我们的 Alexa Fluor® 偶联二抗。我们刚刚发布了 Alexa Fluor® 偶联 405、568 和 750 新系列。这些二抗都已在 Abcam 实验室广泛测试过,以保证明亮的染色和较低的背景。预吸附抗体的选择范围较大,以确保物种交叉反应程度较低。所有产品的稀释度介于 1/200 和 1/1,000 之间,而且产品价格非常优惠。想要了解更多,可访问 abcam.com/Alexa。

Abcam 产品目录还包括一系列用于多色染色的细胞成像工具。探索我们的 CytoPainter 系列试剂盒和试剂,可用于肌动蛋白丝、内质网、高尔基体、线粒体和溶酶体的多色染色。它是一个简易的共定位研究方法,不必在多抗体上浪费时间。CytoPainter 产品可跟二抗和核染料组合使用。右上角的图像展示的是小鼠胚体多色染色的案例。

想实施出色的核染色,何不试一下远红外染料?不到五分钟即可显示核染色。本系列有 DRAQ5 和 DRAQ7,可分别用于活细胞或固定细胞的染色。下图中,细胞核是用 DRAQ7 染色的,蓝色源于 AMCA 偶联二抗。

针对细胞成像,我们有广泛的已验证二抗产品组合,包括预吸附 Alexa 和 DyLight 偶联二抗,用于最小化物种交叉反应。我们的产品系列还有 STED 显微镜用 Chromeo 偶联二抗、高分辨率电子显微镜用 Ab-Gold 偶联二抗。为了增大 IHC 实验中的组织渗透度,我们建议您试用我们的 F(ab')2 片段抗体。对于非荧光成像或酶法检测,Abcam 也有全面的免疫组化产品系列。产品组合包括 EXPOSE IHC 试剂盒,其灵敏度大于聚合物和 ABC 检测体系,会形成较小的检测复合物。IHC 产品组合还包括经典的生物素和链霉亲和素试剂盒以及辅助试剂。如想知道关于细胞成像产品所有系列的更多信息,请访问 abcam.com/imaging 可找到更多详情。

正如 Ann 在网络研讨会中所提到的,保护你的切片免遭光漂白十分重要。针对这一特殊目的,Abcam 还提供一系列荧光封片剂。这些产品供货时可含或不含 DAPI 和 PI 等核染料。

Abcam 技术支持团队会尽力回答您提出的任何问题。团队成员擅长多种语言,可提供法语、西班牙语、德语、中文和日语等多语种支持。您可以通过这里显示的电子邮箱地址和电话号码来联系美国、英国、香港和日本的团队成员。

在 Abcam 网站上,您可以找到各种免费资源和方案。您可能还对我们的新品牌“细胞染色多色成像工具”海报和“了解二抗指南”感兴趣。后者解释了多重染色实验中,使用 F(ab')2 片段和预吸附二抗的情况。请通过 mailrequest@abcam.com 联系我们获取免费的硬拷贝,或者在 abcam.com/posters 网站下载 PDF。

您也可以访问 abcam.com/webinars 网站收听我们过去所有的网络研讨会,包括其他的显微镜相关研讨会,如“如何设计多色染色”和“如何设计 IHC/ICC 实验”。

为了答谢你参加这次网络研讨会,我们愿意给你一个专门的 25% 折扣,用于所有二抗、CytoPainter 产品、IHC 试剂盒、亲和素/链霉亲和素以及 RabMAb。下单时请使用本幻灯片上显示的推广码,享受这一优惠。

现在,就是大家一直在等待的测试答案。正确答案以粗体显示,所以第一个问题:哪种荧光染料通常不用于显微镜?答案是 PE 或藻红蛋白。这种染料在体外以分子量为 240 kDa 的蛋白存在,每分子具有 23 个藻红素发色团。PE 是流式细胞仪所采用的最明亮的荧光染料,但由于它的高度光漂白,所以并不适用于荧光显微镜。

问题二:哪个颜色组合最有可能发生光谱重叠?答案是 A,主要是因为荧光染料 Alexa 555 和 648 有相当高的光谱重叠。

问题三:以下哪一种荧光染料有最高的量子产率?正确答案是 Alexa 488,因为它的量子产率为 0.92,所以它非常接近 1。

在结尾,我想再次感谢 Ann 带来如此有趣的研讨会,并感谢大家的参与。要提醒大家的是,当你退出网络研讨会您将被重定向到一个页面,在该页面上你可以下载幻灯片并找到促销代码和条款和条件。所以,现在,Ann 很乐意回答大家的任何问题。

AW:       多谢你,Miriam。我有几分钟的时间来回答你们通过电子邮件提出的一些问题。那么,我想回答的第一个问题是:从共聚焦显微镜中获得高质量图像的标准是什么?这是个极好的问题。首先,最重要的可能是需要非常有代表性的样品,所以你需要确保,也许不仅仅是你,而是你和其他人,或许是你的上司或实验室同事,都认为你在显微镜中看到的内容与共聚焦所产生的图像一致。

当你想要以出版质量发表你的图像时,你需要知道的是,图像需要有大约 300 dpi 的高分辨率,否则当你真的把它上传到网站进行发表时,它会显得非常粗糙。这是非常重要的——这些图像将放入你的论文中,而且它们会比你在共聚焦屏幕上看到的要小得多。所以很重要的一点是要确保这些图像得到了修正。你需要确保背景是正确的黑色。

如果可以的话,尽量在你的图像中排除任何伪影,那么你才有可能把共聚焦的扫描区域进行旋转,以排除你不想要的东西;如果你在完美的细胞或组织旁边有一块讨厌的杂质,那可真是不幸。

确保所有内容都在检测器的线性范围内,确保你的背景是黑色的但在检测器的线性范围内,所有内容是非饱和的,并且尽量提高对焦。因此,为得到出版质量的图像,您会想要降低扫描速度和平均值。

下一个问题:你如何分辨自发荧光和弱染色?这是一个很好的问题,这个问题很难回答,并且我认为这会给人们带来了很多问题。分辨的最好方法实际上是进行无染色对照,那么你就会仅看到你的组织或细胞。

我所做过的所有共聚焦都有明场选项,所以你可以通过明场来聚焦你的样品,你甚至可以采用共聚焦得到如往常一样的明场图像。然后你就可以得到明场下的样品图像,所以它是聚焦的,然后将共聚焦设置为你想获取的任何染料的设置,比如 Alexa Fluor® 488,然后直接拍摄图像,看看自发荧光的情况。然后你需要做的就是使用这些设置,如果你看不到任何东西,那你必须优化它们,将自发荧光最小化,然后你就可以拍摄你的图像了。

某些共聚焦显微镜还可能配有一种高级工具,叫做光谱混合。在这里我只是提下光谱混合的概念,不会详细讨论,因为这是一个高级应用程序。然而,如果你能去网上查找,会发现网上能查到很多资源。如果你工作的设施有管理部门,那么你的设施管理员可能知道光谱混合。通常,自发荧光的发射光谱与使用的染料的发射光谱略有不同。所以你可以收集自发荧光的发射光谱,然后再进行去除,但这样做的要求可能更高一点。

但是,区分自体荧光和弱染色信号肯定是能做到的,我尝试过,也推荐大家,如果可能的话,尽量优化你的染色方法,让它更亮一点。

那么问题来了,有人问:什么是周边像素驻留?回到幻灯片里,我们讨论图像的地方。实际情况是,共聚焦显微镜观察的方式是一系列小格子,这种小格子就叫做像素,而激光会逐个扫过图像上的像素。像素驻留时间基本上就是激光在移动前,在每个像素上停留的时间长度。而它究竟在那里是停留一毫秒还是一微秒,取决于图像。通常,像素在给定点上停留的时间越长,也就是驻留时间越长,噪音就越小,但样品漂白的几率也越高。

有人问:我能对共聚焦显微镜的图像进行去卷积吗?当然可以,而且对于某些应用来说值得你花这个工夫。所以,如果你真的想提高共聚焦显微镜的分辨率极限,或者你想屌一个大约 200 纳米的东西成像,并且还想做一个 3D 模型。比方说,要对细胞核进行成像的时候,你可能想试着去做一下去卷积。原理上讲,去卷积在是用来消除离焦光的。实践的时候,共聚焦显微镜的针孔也是用来消除离焦光的,所以只有在用完共聚焦显微镜后,你不太确定共聚焦图像里是否留有离焦光的时候,你才真的需要对图像进行去卷积。有些人会这样做,但也有些人不会。我一般建议不要这样做,除非它是非常非常具体和细微的内容,并且共聚焦显微镜的分辨率已达到极限。但我得说,最终还是取决于你、你的团队领导和其他团队成员以及你们所处领域的具体情况。

我想我们还有时间再回答几个问题。我看到有个问题说:所有染料的发射波长和激发波长都相同吗?嗯,这个问题的答案是,不,不完全相同。一般来说,用于组织学的显色染料,比如 H&E,都只是一些小分子,只要用普通的光进行照射,它们就会发光,并且带有颜色,这样就能让你看到了。但荧光染料并不是这样的,它们有所不同,所以,基本上荧光染料都要用高能光源来激发。由于染料的结构,吸收高能光子后需要释放一部分能量,所以需要发射波长较低的光。因此,荧光染料发射光和激发光的波长并不相同,并且发射光的波长取决于染料的化学性质。所以在着手开始之前,你需要仔细了解染料的吸收光谱或激发光谱,还有它的发射光谱。

有人问:请问能否介绍一下共聚焦中颜色通道的使用顺序?老实说,我认为这取决于你使用的仪器。通常,大家会先收集最短的波长,所以会先收集蓝色通道,然后是绿色和红色。但实际上,如果你同步扫描的话,它们都是同时收集的,然后再由发射光路上的分光镜把光分开。因此,二向色光会在一个方向上发送一部分波长,其他方向上发送另一些波长。如果你使用的是逐步染色,那么上它会按蓝色、绿色或红色,或者你设定的随便什么顺序来收集,而且这个完全取决于你自己。共聚焦显微镜预设了一些通道顺序,刚开始使用共聚焦的时候,如果你觉得方便,可以使用这些预设,我能提供的建议也就是这些了。

最后一个问题:共聚焦可以用于福尔马林或石蜡包埋的组织吗,还是只能用于冷冻组织?这个问题的答案是,都可以使用。如果是福尔马林和石蜡包埋的组织,在进行设置的时候要稍微复杂一点,你需要采取一些抗原修复措施。这些措施是有现成的实验方案的,我想 Abcam 的其他网络研讨会可能会涉及这些内容,所以这里我就不提供建议了。当然,这个肯定是能够做到的,你只是需要非常仔细地设置共聚焦显微镜,但两类样品都可以实现,而且我们已经公开过相关的内容。

好的,非常感谢你们的所有问题,也谢谢大家从百忙之中抽出时间来参与。接下来我就交给露西接手了。

LP:          非常感谢,Ann,感谢 Ann 和 Miriam 今天的分析。遗憾的是,由于时间限制,我们没法回答所有的问题。如果哪位的问题还没有得到回复,我们的技术支持团队很快会联系您并予以答复。大家可以下载刚刚的网络研讨会讲座。另外,大家退出这次网络研讨会的时候,会自动跳转到另一个页面,在那里有此次的 PDF 讲义。如果您对今天讨论的内容有任何问题或者技术咨询,我们的技术支持团队会很高兴为您服务。你可以发送邮件到 technical@abcam.com。我们希望这次网络研讨会为您提供了大量的信息,并且对您的工作有所帮助,期待您能来参加将来的网络研讨会。再次谢谢您们的参与,祝大家的研究一帆风顺。

女士们,先生们,今天的网络研讨会到此结束。再次感谢各位今天的参与,大家现在可以下线了。


注册