荧光WB的提示和技巧


使用以下要点快速选择二抗并优化实验方案,开始荧光WB检测。

选择二抗

为了获得清晰明亮的条带,使用针对荧光WB优化过的抗体

  • 当进行多重检测时,确保使用的每个一抗都来自不同物种。
  • 使用预吸附二抗将物种的交叉反应降至最低。

  • IRDye® 二抗针对 600 多种蛋白靶标与荧光WB应用进行了全面优化

IRDye ® 680RD

高表达蛋白(例如,管家基因)

激发:679 nm

发射:696 nm

700 nm 通道 

稀释范围:

1:5,000 - 1:25,000

IRDye ® 800CW

低表达蛋白(例如,目标蛋白质)

激发:778 nm

发射:795 nm

800 nm 通道

稀释范围:

1:5,000 - 1:25,000

    优化抗体 

    获取更高的信噪比

    • 建立一抗、二抗稀释的浓度梯度,测试不同组合,选择其中信噪比最高者,即为最优抗体浓度。

    • 在多重分析前,先分别优化单个抗体的稀释条件(一抗 + 偶联二抗)。

    实验方案中应注意的步骤和试剂

    • 膜可能会产生自发荧光,导致高背景。选择专为这一问题而设计的膜 — 低荧光WB膜 (PVDF)。 

    • 缓冲液中未溶解的颗粒(例如封闭缓冲液中的牛奶粉末)可能会沉淀到膜上,产生伪荧光信号。因此,我们建议使用高品质试剂,确保所有成分能够充分溶解,并过滤所有缓冲液。

    • 小心处理膜,使用钝镊子,避免刮擦/起皱产生伪荧光信号。

    • 用铅笔而非钢笔来标记膜,以防油墨产生荧光。

    • 溴酚蓝会产生自发荧光 — 因此跑胶时让染料前沿跑出凝胶,或转膜时切除染料部分的凝胶。

    • 在孵育和洗涤步骤中使用铝箔避光。

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