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使用以下要点快速选择二抗并优化实验方案,开始荧光WB检测。
选择二抗
为了获得清晰明亮的条带,使用针对荧光WB优化过的抗体
高表达蛋白(例如,管家基因) | 激发:679 nm 发射:696 nm 700 nm 通道 | 稀释范围: 1:5,000 - 1:25,000 | |
低表达蛋白(例如,目标蛋白质) | 激发:778 nm 发射:795 nm 800 nm 通道 | 稀释范围: 1:5,000 - 1:25,000 |
获取更高的信噪比
建立一抗、二抗稀释的浓度梯度,测试不同组合,选择其中信噪比最高者,即为最优抗体浓度。
在多重分析前,先分别优化单个抗体的稀释条件(一抗 + 偶联二抗)。
实验方案中应注意的步骤和试剂
膜可能会产生自发荧光,导致高背景。选择专为这一问题而设计的膜 — 低荧光WB膜 (PVDF)。
缓冲液中未溶解的颗粒(例如封闭缓冲液中的牛奶粉末)可能会沉淀到膜上,产生伪荧光信号。因此,我们建议使用高品质试剂,确保所有成分能够充分溶解,并过滤所有缓冲液。
小心处理膜,使用钝镊子,避免刮擦/起皱产生伪荧光信号。
用铅笔而非钢笔来标记膜,以防油墨产生荧光。
溴酚蓝会产生自发荧光 — 因此跑胶时让染料前沿跑出凝胶,或转膜时切除染料部分的凝胶。
在孵育和洗涤步骤中使用铝箔避光。