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了解如何重编程诱导多能干细胞 (iPSC)、如何保护与分化多能干细胞 (PSC),以及针对不同分化类型的细胞使用哪些标志物
使用多能干细胞 (PSC) 进行的研究已彻底改变了再生医学以及我们模拟人类疾病的方式。这些细胞通常分为两类:来源于囊胚期胚胎的胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPSC),后者从成年体细胞被诱导成为多能细胞。通常,生产和培养这两类 PSC 的目的在于疾病研究、药物发现和正常人类发育研究。
在此,我们将为您介绍 PSC 工作流程中最重要的步骤,包括以下内容。
目录
迫使体细胞表达与多能性相关的转录因子,如 Oct4、Klf4、Sox2、cMyc 等,可以诱导产生 iPSC (Takahashi et al.,2006)。目前已通过多种转录因子组合的方法,成功诱导重编程iPSC细胞的产生。常用的 iPSC 重编程方法有化学方法(Huangfu et al., 2008)和慢病毒和逆转录病毒转染,后者可将编码多能基因的 DNA 整合到宿主基因组中(Yu et al., 2007)。
我们提供多种不同的生化试剂,可以帮您将成体细胞重编程为 iPSC。以下为部分关键示例:
雷帕霉素(mTOR 抑制剂)与 Y27632(ROCK 抑制剂)搭配使用可对人乳腺癌细胞 (MDA-MB-468) 进行重编程,诱导 7 天后的有效率为 90% (Yuan et al., 2018)。使用 2 μM Y27632 和雷帕霉素可以实现这一重编程。
糖原合成酶激酶 3 (GSK-3) 抑制剂 CHIR99021 可用于重编程已转导表达 Oct4 和 Klf4 的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) (Li et al., 2009)。这是首例在 Sox2 未表达情况下产生 iPSC 的情况。我们用 10 μM CHIR99021 对 MEF 细胞进行了四周的处理。
BIX 01294,组蛋白甲基转移酶抑制剂搭配 Oct4 和 Klf4 表达可将小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 重编程为 PSC (Shi et al., 2008)
要想维持 PSC 的多能性状态,需谨慎操作。PSC 需要严格的培养基和传代方法,才可以保持健康和未分化状态。常用的两种 PSC 培养系统分别是饲养层依赖型培养系统或无饲养层培养系统。
饲养层依赖型培养
饲养层依赖型培养系统使用一层饲养层细胞,该层细胞可为 PSC 提供维持其健康和扩增所需的生长因子和细胞外基质蛋白。MEF 通常被用作饲养细胞。
无饲养层培养
无饲养层培养系统使用替代培养基,该培养基可提供 PSC 所需的所有生长因子。这一培养系统使用起来可能更为简单,因为细胞可以在简单的基质包被板上生长,因此您无需担心下游实验前的饲养细胞去除步骤。您也可以使用生化药物来帮助维持无饲养培养系统中的多能性,如 SC-1(多能性)、双激酶和 gtp 酶抑制剂。
此外,您还需查看您的 PSC,确保其仍然处于多能性状态。在 western blot 或 ICC 等应用中使用未分化的细胞标志物来查看这一状态不失为一种很好的方法。检查细胞是否具有多能性时,最好使用未分化的细胞标志物,如 Oct4 和 Sox2。
我们建议您使用以下未分化的细胞标志物:
重组抗 Oct4 抗体 [EPR17929]-ChIP 级 (ab181557)
重组抗 SOX2 抗体 [EPR3131] (ab92494)
重组抗 KLF4 抗体 [EPR20753-25] (ab214666)
重组抗 Nanog 抗体 [EPR20694]-ChIP 级 (ab214549)
您也可以尝试我们的胚胎干细胞标志物套装,为您的研究找到正确的标志物。
胚胎干细胞标志物套装(人:Oct4、Nanog、Tra-1-60、SOX2、SSEA4)(ab109884)
与此处列出的未分化细胞标志物一样,未分化细胞标志物由未分化的 PSC 表达,但单独使用这些标志物并不能保证您所使用的细胞具有多能性。要想充分确定多能性,有必要同时使用功能性检测试剂盒对 PSC 进行检查。
如果您的 PSC 正在培养物中生长,并且您检查后发现它们正在表达未分化的细胞标志物,这时,您就可以开始将 PSC 分化为您感兴趣的细胞类型。由于 PSC 的多能性,它们有可能分化成神经细胞、心肌细胞等任何细胞类型。这种分化可以简单地使用不同的生化试剂和生长因子混合(“cocktail”)来完成。在此,我们列出了PSC诱导分化成各类不同细胞所需要的诱导因子,供大家参考。
生化试剂
神经细胞类型
SB431542, ALK 抑制剂与 Noggin 搭配使用可将 PSC 分化为神经前体细胞 (Chambers et al., 2009)。
AICAR(Acadesine/AICA 核苷), AMPK 激活剂可诱导神经干细胞的星形胶质细胞分化 (Zhang et al., 2008)。
心肌细胞类型
5-氮杂胞苷可促进间充质干细胞向心肌细胞分化 (Makino et al., 1999)。
糖原合成酶激酶 3 (GSK-3) 抑制剂,CHIR99021 可将 PSCs 分化为心肌细胞 (Lian et al., 2013)。
肝细胞类型
丁酸钠可从 ESC 生成肝细胞 (Rambhatla et al., 2003)。
胰腺细胞类型
RepSox, TGF-β1 型受体抑制剂将诱导 PSC 成为胰岛 β 细胞 (Hosoya et al., 2012)。
生长因子和细胞因子
成纤维细胞生长因子 (FGF) 家族成员在干细胞分化为 3 个胚层的过程中发挥重要作用。不同 FGF 蛋白与其他生长因子,如骨形态发生蛋白 (BMP)、Wnts 和表皮生长因子 (EGF) 搭配使用可促使这些胚层分化为特定的细胞类型。下面介绍几种不同细胞类型的生长因子组合。
神经细胞类型
FGF-2 和 EGF 搭配使用可从 PSC 中制备神经前体细胞 (Ostenfeld et al., 2004)。
心肌细胞类型
BMP-2、BMP-4、激活素 A 、FGF 和 Wnt5a 同时使用可促使 PSCs 向心肌祖细胞分化 (Rajala et al., 2011)。
胰腺细胞类型
FGF-10 和 FGF-7 可将 PSCs 分化为胰岛 β 细胞祖细胞 (Shahjalal et al., 2018)
肝细胞类型
Wnt3a、激活素 A、FGF4、BMP-4、肝细胞生长因子 (HGF) 同时使用可生成肝前体细胞 (Du et al., 2018)。
肺细胞类型
BMP-4、Wnt3a、FGF-10、EGF 和视黄酸 (RA) 同时使用可从 PSC 产生肺泡 II 型样上皮细胞 (Ghaedi et al., 2015)。
PSC 分化为目标细胞类型(例如神经、心脏、肺等)后,应该检查细胞是否不再表达上述未分化的细胞标志物(Oct4、KLF-4、c-Myc、Sox2 等)。您可以按照 2. PSC 维护 进行未分化标志物检测来确认
接下来,还应该检查生成的细胞类型是否正是您的目标细胞类型。在此,我们列出了一些标志物抗体,用以检测各种不同的细胞类型。
胚层
中胚层
Brachyury 蛋白: 重组抗 Brachyury/Bry 蛋白抗体 [EPR18113] (ab209665)
CD31: 重组抗 CD31 抗体 [EP3095] (ab134168)
CD34: 重组抗 CD34 抗体 [EP373Y] (ab81289)
BMP2: 重组抗 BMP2 抗体 [EPR20807] (ab214821)
BMP4: 重组抗 BMP4 抗体 [EPR6211] (ab124715)
N-钙粘蛋白:抗 N 钙粘蛋白抗体 (ab18203)
Nodal: 重组抗 Nodal 抗体 [EPR2057] (ab109317)
Snail: 重组抗 SNAIL 抗体 [EPR21043] (ab216347)
内胚层
Sox17: 重组抗 SOX17 抗体 [EPR20684] (ab224637)
FOXA2: 重组抗 FOXA2 抗体 [EPR4466] (ab108422)
GATA4: 重组抗 GATA4 抗体 [EPR4768] (ab134057)
外胚层
巢蛋白:重组抗巢蛋白抗体 [SP103] (ab105389)
Notch1: 重组抗 Notch1 抗体 [EP1238Y] (ab52627)
TP63: 重组抗 p63 抗体 [EPR5701] (ab124762)
神经细胞类型
神经干细胞
Fas: 重组抗 Fas 抗体 [EPR5700] (ab133619)
Frizzled-9: 重组抗 Frizzled 9 抗体 [EPR4011] (ab108628)
MSI1 (Musashi-1):重组抗 Musashi 1/Msi1 抗体 [EP1302] (ab52865)
MSl2 (Musashi-2):重组抗 MSI2 抗体 [EP1305Y] (ab76148)
巢蛋白:重组抗巢蛋白抗体 [SP103] (ab105389)
Noggin: 重组抗 Noggin 抗体 [EPR1561] (ab124977)
Pax-6: 重组抗 PAX6 抗体 [EPR15858] (ab195045)
Sox1: 重组抗 SOX1 抗体 [EPR4766] (ab109290)
Sox2: 重组抗 SOX2 抗体 [SP76] (ab93689)
神经元细胞
α-突触核蛋白: 重组抗 α-突触核蛋白抗体 [MJFR1] (ab138501)
NCAM: 重组抗 NCAM1 抗体 [EP2567Y] (ab75813)
双皮质:重组抗双肾上腺皮质激素抗体 [EPR10935 (B)] (ab167400)
GABA B 受体:重组抗 GABA B 受体 1 抗体 [EPR22954-47] (ab238130)
GAP-43: 重组抗 GAP43 抗体 [EP890Y] (ab75810)
谷氨酰胺合成酶:重组抗谷氨酰胺合成酶抗体 [EPR13022 (B)] (ab176562)
MASH1: 重组抗 MASH1/Achaete-scute 同源体 1 抗体 [EPR19840] (ab211327)
mGluR1α: 重组抗 mGluR1a 抗体 [EPR13540] (ab183712)
巢蛋白:重组抗巢蛋白抗体 [SP103] (ab105389)
Nicastrin: 重组抗 Nicastrin 抗体 [EPR2575Y] (ab68145)
Pax-5: 重组抗 PAX5 抗体 [EPR3730 (2)] (ab109443)
P-糖蛋白:重组抗 P 糖蛋白抗体 [EPR10364-57]-不含 BSA 和叠氮化物 (ab216656)
突触蛋白 I:重组抗突触蛋白 I (磷酸 S553)抗体 [E377] (ab32532)
突触素:重组抗突触素抗体 [YE269] (ab32127)
星形胶质细胞
GFAP: 重组抗 GFAP 抗体 [EPR1034Y] (ab68428)
EAAT1: 重组抗 EAAT1 抗体 [EPR12686] (ab181036)
EAAT2: 重组抗 EAAT2 抗体 [EPR19794] (ab205247)
谷氨酰胺合成酶:重组抗谷氨酰胺合成酶抗体 [EPR13022 (B)] (ab176562)
S100 β: 重组抗 S100 β 抗体 [EP1576Y] (ab52642)
ALDH1L1: 重组抗 ALDH1L1 抗体 [EPR12743 (B)] (ab177463)
少突胶质细胞
NG2: 重组抗 NG2 抗体 [EPR9195] (ab139406)
Olig1: 抗 Olig1 抗体 [EPR6790] (ab124908)
少突胶质细胞特异性蛋白 (OSP):重组抗少突胶质细胞特异性蛋白抗体 [EPR12726] (ab175236)
髓鞘碱性蛋白 (MBP):重组抗髓鞘碱性蛋白抗体 [IGX3421] (ab209328)
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG):重组抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体 [EPR4282] (ab108505)
Sox10: 重组抗 SOX10 抗体 [EPR4007-104] (ab180862)
胰腺细胞类型
胰高血糖素:重组抗胰高血糖素抗体 [EP3070] (ab92517)
胰岛素:重组抗胰岛素抗体 [EPR17359] (ab181547)
胰岛素-1:重组抗胰岛 1 抗体 [EP4182] (ab109517)
胰多肽:重组抗胰多肽抗体 [EPR22853-61] (ab255827)
PDX-1: 重组抗 PDX1 抗体 [EPR3358 (2)] (ab134150)
肝细胞类型
甲胎蛋白: 重组抗-α1甲胎蛋白抗体 [EPR9309] (ab169552)
白蛋白:重组抗白蛋白抗体 [EPSISR1] (ab137885)
HNF-1α: 重组抗 HNF1α 抗体 [EPR23054-142] (ab242140)
Tat-SF1: 重组抗 Tat-SF1 抗体 [EPR9105 (B)] (ab134921)
心肌细胞类型
α-辅肌动蛋白: 重组抗肌节 α 辅肌动蛋白抗体 [EP2529Y] (ab68167)
心肌肌钙蛋白 I: 重组抗心肌肌钙蛋白 I 抗体 [EP1106Y] (ab52862)
心肌肌钙蛋白 T: 重组抗心肌肌钙蛋白 T 抗体 [EPR3695] (ab91605)
GATA4: 重组抗 GATA4 抗体 [EPR4768] (ab134057)
GATA6: 重组抗 Gata6 抗体 [EPR3990 (N)] (ab175927)
肌细胞生成素:重组抗肌细胞生成素抗体 [EPR4789] (ab124800)
Nkx2.5: 重组抗 Nkx2.5 抗体 [EPR20168] (ab205263)
参考文献
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