明胶酶活性检测
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找到研究检测 MMP-2 和 MMP-9 的最佳实验方法。
MMP-2 和 MMP-9 研究所面临的挑战
复杂的 MMP-2 和 MMP-9 调节机制，使得其活性检测充满挑战。MMP 合成后是无活性的酶原，必须通过酶水解前肽结构域才能被激活。激活后其酶活受到内源性金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs) 的调控。
经典的检测方法（如 WB、ELISA 或 IHC）可以定量 MMP 的蛋白丰度或进行定位，却不足以检测其蛋白活性1。 MMP-2 和 MMP-9 的活性检测方法有多种，你可以找到最适合的。
检测方法一览表
适用样本类型：条件培养基、组织提取物。
工作原理：使用内含明胶的非还原性 SDS-PAGE 凝胶，电泳分离蛋白。然后，从凝胶中除去 SDS，并将凝胶浸没在含有酶活性所必需的辅助因子溶液中。凝胶内的 MMP 蛋白酶解明胶，在考马斯亮蓝染色后，深蓝色背景上产生清晰条带。
优点：凝胶酶谱法是一种简单、低成本、高灵敏度的活性检测方法3。当使用2D凝胶电泳时，不同的明胶酶及其活性和酶原形式，可以根据凝胶的迁移状况来进行区分4。
注意事项：该方法适用于定性或半定量检测，但很难用于定量检测2。另外，凝胶酶谱法很难处理多个样本，不适合高通量分析。
MMP 调节因子如 TIMPs 在电泳过程中与 MMP-2 和 MMP-9 分离，因此凝胶酶谱法不能准确测定酶的体内活性，只能估算组织中的最大潜在活性。
应用：粗略测定少量生物或临床样本的最大活性2。
我们向您提供明胶酶谱检测 protocol。
适用样本类型：条件培养基、组织提取物。
工作原理：底物检测需要使用 MMP-9 底物肽，这种底物肽一端含有荧光基团，另一端含有淬灭剂。在其完整状态下，由于荧光淬灭而荧光最小。
与液体样本结合后，多肽被样本中的 MMP-9 水解；淬灭剂扩散离开荧光基团，荧光增强。
类似的还有使用生物素化明胶和琥珀酰化明胶的非荧光检测5,6。
优点：底物检测法可以提供高灵敏度的定量数据，可与ELISA配搭使用来计算特异的酶活性7。该检测方法快速，可以高通量。
注意事项：组织均桨可能导致酶和抑制剂的人工混合，从而使得到的结果并不能真实的反应体内活性8。另外，如果合成的多肽与内源性底物的结构有差异，可能会影响酶动力学，使得结果不准确。不过，人们已经开发出了更接近天然底物结构的三螺旋底物9。
MMP-9 和 MMP-2 有着相似的底物特异性，很难区分它们的酶活性。使用抗体对 MMP-9 或 MMP-2 进行分离可以避免该问题10。
应用：高通量定量检测。
我们向您提供 MMP 活性检测（荧光绿）protocol。
适用样本类型：冰冻组织切片，乙醇或锌固定石蜡包埋的组织切片1。
工作原理：使用荧光底物肽浸浴组织切片。由于荧光底物被组织切片中的 MMP-9 水解，荧光背景上出现黑洞。
该检测方法还有另一种高度淬灭的版本，使用的是淬灭的荧光底物。在这种情况下，底物降解导致淬灭消失，使得酶活性区域的荧光增强。
优点：该技术检测原位内源性的明胶酶活性。它可以只检测酶的活性，因为无活性的前体和酶抑制剂复合物并没有被破坏。该方法成本相对较低，操作简便。
注意事项：原位酶谱法不能定性，且难以高通量检测。如果合成的多肽与内源性底物的结构有差异，可能会影响酶动力学，使得结果不准确。
MMP-2 和 MMP-9 具有相似的肽识别序列；因此，检测到的活性很可能是它们的总活性。如果要区分这两种酶的活性，可以使用平行组原位杂交，或是特异性的抑制剂。
应用：定位而非定量检测。
我们向您提供经 IHC 验证的 MMP-9 抗体和抑制剂。
样本类型：活组织或整个有机体。
工作原理：将荧光底物（如改良的 IV 型胶原）注射到组织中。底物含有荧光基团和淬灭剂，或者被高度淬灭，水解后荧光增强。
优点：实时 3D 检测 MMP-9 活性。样本制备带来的影响最小化。
注意事项：体内酶谱法提供定性数据，而不是定量数据。与其他技术一样，使用合成肽可能无法反应真正的体内酶活性。
应用：体内观察 MMP-9 活性。
参考文献
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