将 CRISPR 用于药物发现产品线

CRISPR-Cas9 在多项检测中被用于提高药物研发的准确性和速度。

​​CRISPR 技术革命加快了基因编辑细胞在各种药物开发检测中的使用速度。CRISPR-Cas9 基因编辑提高了临床前药物开发过程的准确性和速度。该技术可以确保精确的靶点调节，从而优化命中效果；也可以增强检测，从而提高疾病重现和快速应对临床结果的能力^1,2。

​

概述

• 检测 CRISPR 效果
• 病例研究 1：利用 CRISPR 对下一代候选药物进行 HTS
• 病例研究 2：通过 CRISPR 编辑 iPSC 分化识别基因靶点 ID
• 病例研究 3：使用 CRISPR 编辑细胞测试新的肿瘤学靶点

检测 CRISPR 效果

功能基因组筛选成功的三个要素：

• 特异干扰基因功能的能力
• 测定表型反应的检测
• 结合观察结果进行基因识别的机制

每个要素都需要根据正在研究的生物学进行调整¹。CRISPR 可以进行精确的靶向基因编辑，因而支持全基因敲除、靶向基因敲入或通过 CRISPRa/i 激活或抑制部分基因。要想检测细胞对基因干扰和任何化合物的反应，从而治疗此类疾病，选对检测方法非常重要²。 正确的检测方法能够确保收集到正确的数据，同时确保检测期间对基因功能或命中 ID 的解释准确。

CRISPR 编辑细胞最先在癌症生物学中得到应用。在这些研究中，根据基因敲除细胞系对简单细胞存活检测的反应，即可预测潜在溶瘤基因过表达肿瘤的药物反应¹。但是，对于更加复杂的疾病或者说您想要呈现细胞行为的完整图像，从而确定准确的命中 ID，细胞健康等检测可能无法提供所需的信息。在这种情况下，必须在应用基于 CRISPR 的筛选技术的同时，使用更加先进的表型分析。

CRISPR 目前已在整个临床前阶段的一系列 in vitro 和 in vivo 检测中被用于改善试验结果和加快检测过程。研究表明，CRISPR 筛选研究最常检测的细胞终点是报告基因，其次是细胞增殖和蛋白分泌。CRISPR 编辑细胞检测的其他目标终点包括细胞凋亡、细胞活性（膜完整性）、表型变化的高内涵成像，以及细胞周期分析³。这些检测通常同时使用 CRISPR 编辑细胞系和亲代野生型（WT）细胞系进行，以便比较发生的反应 ²。

以下病例研究显示了应用 CRISPR 提高药物发现过程准确性和速度的方法，提供了之前技术无法提供的答案。

病例研究 1：利用 CRISPR 对下一代候选药物进行高通量筛选

吉非替尼和厄洛替尼可以在治疗非小细胞肺癌期间靶向表皮生长因子受体（EGFR）⁴。在观察到患者对这些治疗的耐药性后，可以确定 EGFR 中的 T790M 致癌突变是导致耐药性的原因，这一突变阻止了药物与 EGFR 酪氨酸激酶结构域靶点的相互作用^5,6。阿斯利康基于结构性设计研发了奥希替尼，它可以靶向 T790M 突变。但是，在临床试验中，可以观察到 EGFR 出现了二次获得性突变 C797S，再次导致耐药性⁷。

​

​吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼的化学结构。由于患者对每种药物出现了耐药性，因此可以利用 CRISPR 工程快速确定治疗 NSCLC 患者的新一代新型治疗药物。

为了避免不必要的研发成本，同时加快该领域的进程，他们找到了一种可以快速将相关信息反馈至临床前药物发现项目的方法。他们使用CRISPR-Cas9在癌细胞系中生成准确的 C797S 突变，以供 in vitro 和 in vivo 使用。然后应用相关的 C797S 细胞系模型进行药物筛选，确定靶向该新突变的下一代新型化合物。将该策略的目标患者的 CRISPR 编辑细胞系模型暴露于筛选中的候选药物化合物，然后通过高通量 ELISA 分析结果，最后确定精准药物 ⁷。​​

病例研究 2：通过 CRISPR 编辑 IPSC 分化识别基因靶点 ID

巨噬细胞是先天性免疫应答的一部分，可以改变其生理学和细胞因子特征，从而促进损伤后的炎症和组织修复。在慢性阻塞性肺病（COPD）患者中，肺细胞中的抗炎巨噬细胞活性降低⁸。

有人提议将盐诱导激酶（SIK）作为 COPD 的药物靶点。默克公司的研究表明，抑制该靶点可以改变巨噬细胞的细胞因子谱，促进抗炎反应，增加 IL-10 并抑制 TNFα⁹。

SIK 在人体内以三种不同的亚型表达。为了确定导致 COPD 的亚型，研究人员转向 CRISPR-Cas9 研究。他们使用 CRISPR 在诱导多能干细胞（IPSC）中生成了不同激酶亚型的双等位基因点突变。然后通过区分单核细胞和巨噬细胞分析了对不同激酶进行基因敲除的 CRISPR IPSC 细胞系。实验表明，人 iPSC 衍生的巨噬细胞产生的细胞因子谱与人类原代单核细胞衍生的巨噬细胞非常相似，因此，这些 CRISPR 编辑的iPSC 细胞系可以作为合适的实验模型系统¹⁰。

基于该系统，在细胞中使用脂多糖时，在细胞活性检测期间观察到一种 SIK 亚型组合导致 IL-10 蛋白倍数减少，符合预期¹⁰。根据该结果，研究人员能够识别正确的靶点，并从假设阶段进入人类概念验证阶段。

病例研究 3：使用 CRISPR 编辑细胞测试新的肿瘤学靶点

2014 年，2 篇研究论文基于 RNAi 敲低结果强调，MutT Homolog 1 (MTH1) 可以作为一种潜在的肿瘤新靶点 ^{11, 12}。此后，阿斯利康研究人员试图重复并扩展该靶点的验证工作¹³。他们利用 CRISPR-Cas9 将 Indel 引入 MTH1 基因的外显子 2，以此创建了 MTH1 基因敲除细胞系，然后使用 western blot 进行了全蛋白敲低。由此获得的 KO 细胞系与 WT 细胞系表现出了同等的细胞生长速度¹³。随后，他们使用特异性抑制剂对 MTH1 KO 细胞作了进一步处理，结果显示 KO 细胞系和 WT 细胞系的细胞活性不存在任何差异¹³。使用该 CRISPR 方法可以排除靶点，节省寻找错误的靶点所需的资源。

CRISPR-Cas9 准确度高，有利于加快药物发现和开发速度；由于该技术正逐步被纳入各项检测设计的工作流程中，我们希望看到临床前药物产品线带来更好的结果。

                          

参考文献

1. Lawo S and le Sage C. How Phenotypic CRISPR Screening is Revolutionising Drug Discovery. DDW. Fall: 53-58. (2018)
2. Scott A. How CRISPR is transforming drug discovery. Nature 555, S10-S11 (2018)
3. Comley J. CRISPR Cas9: Transforming Gene Editing in Drug Discovery Labs. DDW. 17(4):33-48 (2016)
4. Nurwidya F, Takahashi F, Takahashi K. Gefitinib in the treatment of nonsmall cell lung cancer with activating epidermal growth factor receptor mutation. J Nat Sci Biol Med. 7(2): 119–123 (2016)
5. Arcila ME, Oxnard GR, Nafa K, Riely GJ, Solomon SB, Zakowski MF,  et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clin Cancer Res. 17(5):1169-80. (2011)
6. Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, Digumarthy S, Turke AB, Fidias P,  et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3(75):75ra26 (2011)
7. Thress KS, Paweletz CP, Felip E, Chul Cho B, Stetson D, Dougherty B,  et al. Acquired EGFR C797S mediates resistance to AZD9291 in advanced non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. 21(6): 560–562. (2015)
8. Barnes PJ. Inflammatory mechanisms in patients with chronic obstructive pulmonary disease. J Allergyl Clin Immunol. 138(1): 16-27 (2016)
9. Clark K, MacKenzie KF, Petkevicius K, Kristariyanto Y, Zhang J, Geun Choi H, et al. Phosphorylation of CRTC3 by the salt-inducible kinases controls the interconversion of classically activated and regulatory macrophages. Proc Nat Acad Sci. 109(42):16986-16991 (2012)
10. Mayr L. CRISPR/Cas9 in drug discovery: Applications in target discovery, validation, and hit screening. Science [Accessed: 27/-7/2020] (2016)
11. Ged H, Koolmeister T, Jemth AS, Eshtaf S, Jacques SA, Strӧm CE,  et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508:215-221 (2014)
12. Huber KVM, Salah E, Radic B, Gridling M, Elkins JM, Stukalov A,  et al. Stereospecific targeting of MTH1 by (S)-crizotinib as an anti-cancer strategy. Nature 508:222–227 (2014)
13. Kettle JG, ALwan H, Bista M, Breed J, Davies BL, Eckersley K, et al. Potent and Selective Inhibitors of MTH1 Probe Its Role in Cancer Cell Survival. J Med Chem. 59(6):2346-61 (2016)