All tags Western blot protocols 用于重染色的蛋白质印迹膜再生(membrance stripping)方案

用于重染色的蛋白质印迹膜再生(membrance stripping)方案

​​我们的蛋白质印迹膜再生和重染色实验方案包括从蛋白质印迹膜上除去抗体的逐步细节。

打印此实验方案。

膜再生是用于描述从蛋白质印迹膜上除去一抗和二抗的术语。在同一印迹上研究一种以上的蛋白质(例如目标蛋白和上样对照)时,膜再生非常有用。在检测多个靶标时,不需要电泳和印迹多块凝胶,而是在一张膜上进行再生和重新检测,这具有节约样品和材料、节省时间的优点。

不建议在膜再生前后对检测靶标进行定量比较,因为膜再生过程会从膜上除去部分样品蛋白质。同样,不应检测再生膜来证明蛋白质的缺失。



强烈推荐可尽量降低样品蛋白质损失的 PVDF 膜。还应注意,比色/显色检测试剂会在膜上留下永久可见的印迹,可能干扰相似分子量靶标的后续检测。推荐例如 ECL 的化学发光试剂,因为它们不会留下印迹,并且比比色试剂更敏感。



以下两个实验方案的区别在于处理的强度。根据一般经验,首先尝试较温和的实验方案,如果仍有试图除去的抗体信号,再进行高强度的实验方案。这些步骤可重复用于与多个抗体杂交的情况,但每次膜再生之后潜在的信号可能更弱,背景可能更高。有些研究人员报道了膜再生十次或更多之后成功染色的示例。



可通过用化学发光检测试剂孵育膜来检查再生效率。如果再生效果令人满意,用缓冲液冲洗膜若干次,然后在孵育抗体前进行封闭。


​温和再生处理

缓冲液,1 L

​15 g 甘氨酸
1 g SDS
10 mL Tween 20
溶于 800 mL 蒸馏水中
调整 pH 至 2.2
加蒸馏水至 1 L

​实验步骤

  1. 用能覆盖膜的缓冲液在室温下孵育 5–10 分钟。
  2. 弃去缓冲液
  3. 用新配制的膜再生缓冲液重新孵育 5-10 分钟
  4. 弃去缓冲液
  5. 在 PBS 中洗涤 10 分钟
  6. 在 PBS 中洗涤 10 分钟
  7. 在 TBST 中洗涤 5 分钟
  8.  在 TBST 中洗涤 5 分钟
  9. 可用于封闭



​高强再生处理

在通风橱中配制缓冲液和准备再生膜。

缓冲液,0.1 L

20 mL SDS 10%
12.5 mL Tris HCl,pH 6.8,0.5 M
67.5 mL 蒸馏水
在通风橱加入 0.8 mL β-巯基乙醇

实验步骤

  1. 将缓冲液加热到 50 ℃
  2. 将缓冲液加入具有密闭盖的小塑料盒中;加入能覆盖膜的缓冲液
  3. 放入膜。在 50 ℃ 下孵育最多 45 分钟,偶尔摇动
  4. 按照 β-巯基乙醇缓冲液的要求处理溶液
  5. 在自来水龙头下冲洗膜 1-2 分钟
  6. 微量 β-巯基乙醇会破坏抗体。在 TBST 中充分洗涤 5 分钟
  7. 可用于封闭
注册