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没有染色
一抗和二抗不匹
结合到目标蛋白的一抗不足
抗体可能不适于蛋白以天然状态( 3D 形式)呈现的 IHC
一抗/二抗/放大试剂盒可能由于储存不当、稀释不当或反复冻融而失活
检测组织中不存在目的蛋白
组织中目标蛋白丰度不够
二抗未避光储存(如果检测系统是免疫荧光)。
脱蜡不充分
固定过程(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)可能改变了抗体识别的表位
蛋白位于核内,抗体(核蛋白)不能进入细胞核
PBS 缓冲液被细菌污染,破坏了目标蛋白上的磷酸基团
背景偏高
可能未封闭非特异性结合,或封闭不充分
一抗浓度可能过高
孵育温度可能过高
二抗可能非特异性结合
组织洗涤不充分,仍含有固定剂
内源过氧化物酶有活性
固定过程(使用福尔马林或多聚甲醛固定剂)引起自发荧光(如果检测系统是免疫荧光)
过度放大(放大技术)
底物过多(酶检测)
色原与细胞//组织中的 PBS 反应(酶检测)
非特异性染色
一抗/二抗浓度可能过高
内源过氧化物酶有活性
一抗的种属来源与组织样本的种属相同(例如,用小鼠一抗测试小鼠组织)。加入二抗时,二抗会结合样本,因为二抗来源于该种属
切片/细胞变干
使用对照
阳性对照
为什么需要阳性对照:
要验证样品染色,需要使用阳性对照。阳性对照是已知表达目的蛋白的细胞系或组织切片。如果阳性对照的结果呈阳性,即使样品呈阴性,也能说明流程的优化性和可行性。阳性结果可证明任何阴性结果的有效性。
如何确定适用为作阳性对照的组织类型或细胞系:
阴性对照
为什么需要阴性对照:
阴性对照是已知不表达检测蛋白的细胞系或组织切片。使用阴性对照的目的是检查是否存在非特异性结合和假阳性结果。推荐的阴性对照组织是敲低 (KD) 或敲除 (KO) 组织样品。
无一抗对照
同型对照
使用转染的细胞系作为对照:我们推荐在检测重组蛋白样本时,加上内源性对照。这应是实验设计的重要部分。