去除叠氮化钠的实验方案
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将叠氮化钠从抗体溶液中去除的具体步骤
叠氮化钠是一种用于抑制污染物（如细菌或真菌）生长的防腐剂。然而，它在抗体溶液中的存在会影响细胞培养过程中抗体的使用，因为它有细胞毒性。它还会干扰抗体和偶联物的偶联，以及抑制辣根过氧化物酶的活性。
许多Abcam抗体产品含有叠氮化钠，这个信息是在各个抗体的数据表上都会列出。如果该抗体是用于细胞培养实验或需要偶联，建议从抗体溶液中去除叠氮化钠。
下面的三个步骤可以用来除去叠氮化钠。
透析
一个透析装置可以用来将0.1毫升到70毫升的样品中的叠氮化钠去除。这是一种半透膜，可以选择较宽范围的不同大小尺寸和孔径大小。使用一个孔径大小可以截留10-30kDa大小以上物质的膜将允许叠氮化物通过膜，但在溶液中将保留抗体和其他蛋白。
IgG的分子量为150 kDa（IgM为600 kDa）。叠氮化钠的分子量是65 Da。
所需材料
- 可以容纳样本体积的合适直径和长度的透析膜/管（10-30 kDa分子量被截留）
- 透析缓冲液，如PBS, TBS or HEPES (pH 范围 6–8)
- 大烧杯
- 4°C 工作的磁力搅拌机
- 搅拌子
-
步骤
- 按照制造商的建议，组装透析装置。用透析缓冲液预先润洗透析装置1-2分钟的时间来使膜润湿。
- 将抗体溶液转移至透析装置。
- 将透析装置放入一个装有至少1 L缓冲液的合适大小的烧杯中，并将烧杯放在一个磁搅拌器上来让抗体被透析出来，在4°C的情况下至少透析1 h。
- 更换缓冲液然后再透析至少一小时，重复更换缓冲液至期望的次数为止。确保缓冲液至少更换了3遍。
如果可能的话，所有的材料都应该消毒，并相应的准备操作保持无菌。由于抗体不再受防腐剂的保护，因而推荐将抗体保持在低温条件。
脱盐
该步骤适用于体积较小的1-3毫升，脱盐柱有尺寸排阻性，由具有一定孔隙大小的小颗粒组成。
尺寸排阻是一种根据分子量来分离溶液中分子的方法。不同分子量的粒子将以不同速率通过尺寸排阻基质洗脱下来。例如，大分子不能进入基质的孔隙，因此首先被洗脱下来，而较小的分子则会渗入珠子而最后才被洗脱下来。
Sephadex G25色谱柱系统或等效的装置能有效地从抗体样品中去除叠氮化钠。预包装的Sephadex离心柱是现成的，可用于此过程。
所需材料
Sephadex G25 离心柱
平衡缓冲液
离心机
步骤
- 如果使用商业化的纯化柱，使用时请参考制造商的说明书
- 去除离心柱上的盖子，然后1000g离心2分钟以除去存储液。
- 把柱子放在收集管里。
- 按制造商的建议用平衡缓冲液填满柱子，然后1000g离心2分钟。
- 重复3次，然后丢弃穿透液。
- 将1-3ml抗体样品缓慢地加入到填充层的中央，并1000g离心2分钟。
- 收集并回收在收集管中的洗脱液（抗体）。
抗体纯化试剂盒
商业化的抗体纯化试剂盒也可被用于除去叠氮化钠。
下面的Abcam试剂盒可用于从含有BSA、甘氨酸、Tris或叠氮化钠的抗体溶液中纯化抗体。它也可以用来纯化来自粗品的抗体，如腹水或免疫血清。
该方法涉及了在Protein A树脂上捕获抗体，以及通过一个简单的洗涤步骤去除不需要的物质，这可以用标准的微量离心机来完成。然后，洗脱并中和纯化产物。