蛋白质印迹（Western blot）样品制备

*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物。这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用。请参阅我们的亚细胞组分分离实验方案。
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裂解缓冲液配方：

NP-40 缓冲液

• 150 mM 氯化钠
• 1.0% NP-40（可用 Triton X-100 替代 NP-40）
• 50 mM Tris，pH 8.0

这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用 RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）

•  150 mM 氯化钠
•  1.0% NP-40 或 Triton X-100
•   0.5% 脱氧胆酸钠*
•   0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
•   50 mM Tris，pH 8.0

*可制备成 10% 的母液，避光保存。

RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含 NP-40 或 Triton X-100 的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如 SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如 Triton X-100）。

使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用 Dounce 匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用 Tris 缓冲液即可，但如前文所述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。

Tris-HCl 缓冲液

•  20 mM Tris-HCl，pH 7.5

Tris-Triton 缓冲液（细胞骨架蛋白）

•   10 mM Tris，pH 7.4
•   100 mM NaCl
•   1 mM EDTA
•   1 mM EGTA
•   1% Triton X-100
•   10% 甘油
•   0.1% SDS
•   ​0.5% 脱氧胆酸盐

​以上 4 种缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，分装之后可在 -20 ℃ 下储存长达 1 年。

​蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在 4 ℃ 下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。

许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，但您也可以自行制备抑制剂混合物。

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制备原钒酸钠

所有步骤均在通风橱中进行。

1.       用双蒸水制备 100 mM 原钒酸钠溶液。

2.       用 HCl 将 pH 调节至 9.0。

3.       煮沸至无色。稍微盖住溶液，尽量减小由蒸发造成的体积变化。

4.       冷却至室温。

5.       再次将 pH 调节至 9.0。

6.       煮沸至无色。

7.       重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的 pH 保持 9.0。

8.       用水补至初始体积。

9.       分装之后保存于 -20 ℃。如果样品变黄，丢弃样品。
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​制备细胞培养物裂解物

1.       将细胞培养皿置于冰上，用预冷的 PBS 洗涤细胞。

2.       吸出 PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（每 10⁷ 细胞/100 mm 培养皿/150 cm² 培养瓶加入 1 mL；每 5×10⁶ 细胞/60 mm 培养皿/75 cm² 培养瓶加入 0.5 mL）。

3.       用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。或者，也可先用胰蛋白酶处理细胞并用 PBS 洗涤，再用裂解缓冲液在微量离心管中悬浮细胞。

4.       在 4 ℃ 下以恒定速率搅拌 30 分钟。

5.       4 ℃ 下在微型离心机中离心。您可能需要根据不同的细胞类型调整离心力和离心时间；建议以 12,000 rpm 离心 20 分钟，但具体设置须根据您的实验确定（例如，离心白细胞时应采用较为温和的离心设置）。

6.       轻轻地从离心机中取出离心管并置于冰上，吸取上清液并转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。

​制备组织裂解物

1.       用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。

2.       将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行速冻。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。

3.       对于约 5 mg 的组组，向离心管中快速加入约 300 μL 预冷的裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外2x 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃ 下持续搅拌 2 小时（例如，置于冰箱中的回旋振荡器上）。裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。蛋白质提取物不应过度稀释，避免蛋白质损失和凝胶上样体积过大。我们推荐的最低浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1–5 mg/mL。

4.       使用微量离心机在 4 ℃ 下以 12000 rpm 离心 20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管，将其置于冰上，吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中。弃去沉淀。
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确定蛋白质浓度

1.       进行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析。通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作为蛋白质标准品。

2.       确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 以备后续使用，或以备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。
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​制备用于凝胶上样的样品

​变性、还原样品

抗体通常识别目标蛋白的一小部分（被称为“表位”），这一结构域可能位于蛋白质的三维结构内。要使抗体能够接近该部分，必须使蛋白质展开，即使其变性。

要使蛋白质变性，加入含阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液，并在 95–100 ℃ 下煮沸混合物 5 分钟。也可在 70 ℃ 下加热混合物 5–10 分钟，这种处理方式适用于多次跨膜蛋白研究。煮沸处理使膜蛋白质聚集，而蛋白质聚集体无法有效进入凝胶中。

标准的上样缓冲液被称为 2× Laemmli 缓冲液（Laemmli UK, 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bateriophage T4.Nature, 227, 680–5)。也可将其制备成 4× 和 6× 缓冲液，以尽量降低样品的稀释度。2× 缓冲液应按照 1:1 的比例与样品混合。

2× Laemmli 缓冲液配方

• 4% SDS
• 10% 2-巯基乙醇
• 20% 甘油
• 0.004% 溴酚蓝
•  0.125 M Tris HCl
•  ​测定 pH 值并将 pH 调整为 6.8

用 SDS 处理蛋白质时，所有蛋白质都附着在 SDS 阴离子上并因此带负电荷。SDS 和蛋白质以 1.4:1 的质量比特异性地结合，因此 SDS 赋予多肽的负电荷与其长度成正比。变性的多肽变为带负电荷的“棒”，且单位长度的电荷密度相等。因此，多肽的迁移取决于多肽的分子量，而不是多肽的固有电荷。

SDS 的纯度对于实现高质量的蛋白质分离至关重要：如果整块凝胶的蛋白质染色背景中的蛋白质条带模糊不清或只能勉强看清，表明所用的 SDS 过于陈旧或质量不佳。向缓冲液中加入 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇能减少二硫键，这对于根据分子大小进行的蛋白质分离十分必要。

向上样缓冲液中加入甘油可增加待上样样品的密度，从而将样品维持在样品孔底部，避免样品外溢和凝胶中上样不均匀。

为了使蛋白质的迁移可见，通常要向上样缓冲液中加入小分子阴离子染料（例如溴酚蓝）。由于染料为阴离子且分子较小，它的迁移速度比混合物中所有待分离的组分都快，因此提供了可监测分离进程的迁移前沿。

处理蛋白质样品的过程中，加热步骤前后都应涡旋混合样品，以使蛋白质的分辨率达到最佳。
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天然、非还原样品

某些抗体可识别由不连续氨基酸组成的表位。虽然组成表位的氨基酸在一级序列中相互分离，但它们在蛋白质的折叠三维结构中相互靠近，抗体只能识别折叠结构表面上的表位。

在这种情况下，必须在非变性条件下进行蛋白质印迹，数据表的应用部分将对此加以说明。一般来讲，非变性条件即不向样品和迁移缓冲液中加入 SDS，并且不加热样品。

某些抗体只能识别非还原形式的蛋白质（尤其是半胱氨酸残基），在这种情况下，上样缓冲液和迁移缓冲液中不应添加 β-巯基乙醇和 DTT。