RNA提取和逆转录实验方案：细胞培养物

1.细胞的 RNA 分离流程

1.1 使用至少 10⁶ 个细胞，吸出培养基，并用冷的 PBS（1-2 mL）洗涤一次。

1.2 吸出 PBS（尽可能多地去除 PBS）并加入 1 mL TRIzol。

1.3 轻轻刮擦检测板，然后用移液管吸出 TRIzol，并将 TRIzol/细胞裂解液转移至 1.5 mL Eppendorf 离心管中。

1.4 室温下静置 5 分钟。

1.5 加入 250 µL 氯仿，剧烈振摇试管约 15 秒。

1.6 室温下静置 5 分钟。

1.7 按照 10,000 rpm 的转速离心 5 分钟；

1.8 这时，离心管中应有三层物质：

上层：透明、水相

中层/中间相：白色沉淀 DNA

底层：粉色有机相

用移液管小心地去除水相。留一些水相（DNA 层上方约 1 毫米，用于防止 DNA 污染）。放入另一个 1.5 mL Eppendorf 离心管中。

提示：开展上述操作时，应避免使用大容量移液管（大容量移液管很难控制抽取液体的速度和力度，可能会抽取到一些有机相或 DNA 相。

1.9 在水相中加入 550 µL 异丙醇，轻轻混匀。室温下静置 5 分钟。

1.10 按照最大转速（14,000 rpm）离心 20 分钟；如果预计收率较低，则离心 30 分钟。

1.11 将样本放置于冰上。每个试管的底部应有一些隐约可见的沉淀物。倒掉异丙醇，向 DEPC 处理过的水中加入 1 mL 75% 乙醇。轻轻混合。以 9,500 rpm 的转速离心 5 分钟。

1.12 倒掉乙醇，晾干沉淀物。这一步很关键；如果沉淀物过度干燥，RNA 就会结晶并且很难再溶解。如果乙醇蒸发不充分，则会妨碍 RNA 进入溶液。

1.13 倒掉大部分乙醇洗涤液，Eppendorf 离心管底部留约 30–40 µL 溶液。为加快蒸发速度，可将试管进行短暂离心，将试管壁的剩余液体甩至底部，然后尽可能多地吸出乙醇。向 RNA 沉淀中加入 DEPC 处理水的最佳时机是沉淀周围溶液仅剩一个小的弯月面时。

1.14 向 RNA 沉淀中加入约 15–25 µL（取决于收率）DEPC 处理过的 TE 缓冲液或水。在一个小容量 Eppendorf 离心管中，按照 1/40 的比例稀释 RNA（在 48.8 µL TE 缓冲液中加入 1.2 µL RNA 沉淀）并加至微量比色皿中（光程 = 1 cm）。然后测定 260 nm 处的吸光度。260/280 比值应大于 1.8。如果小于 1.5-1.6，则表明至少有部分 RNA 发生降解。如果比率更低，则表明存在 DNA 或硫氰酸盐污染。RNA 浓度基本上就是 260 nm 处的 OD 值（单位：µg/µL）。

替代步骤：组织的 RNA 分离流程

该流程只有前几个步骤与细胞的 RNA 分离流程不同：

1.1 在无菌培养管（12×75 mm 最佳）中加入 1 mL TRIzol。向该管中加入冷冻组织（尽量控制在约 20 mg 以下）。

1.2 在冰上用匀浆器研磨组织，匀浆器设置为 25/30，共研磨 2 次，每次 10 秒。

1.3 将 TRIzol 溶液倒入 1.5 mL Eppendorf 离心管中，然后按照上述步骤 1.4 及后续步骤进行操作。

2. RNA 样本的 Dnase 处理

DNase 混合液（每份样本）包含：

• RQ1 不含 RNase 的 DNase：1 µL
• DNase 10X 反应缓冲液：2 µL
• DEPC 处理过的水：6 µL
• RNase Out：0.5 µL

2.1 根据待处理的 RNA 样本数量，制备上述预混液。

2.2 按以下方式制备 RNA：向一个小容量 Eppendorf 离心管中加入 2 µg RNA（用 2 µg 除以测得的 RNA 浓度 (µg/µL)）。再加入 DEPC 处理过的水，至 RNA 的总体积达到 11 µL。

例如，当 RNA 浓度为 1 µg/µL 时，则在 9 µL DEPC 处理过的水中加入 2 µL RNA。

2.3 在 RNA 中加入 9 µL DNase 预混液，至总体积达到 20 µL。

2.4 使用热循环仪，在 37°C 下孵育样本 15 分钟，再在 65°C 下孵育样本 20 分钟，然后放置在冰上。

2.5 短暂离心各个样本，确保所有样本均集中在试管底部。然后经过 DNase 处理的 RNA 即可用于逆转录反应。

3.经 DNase 处理的 RNA 的逆转录

3.1 大多数情况下，需使用逆转录酶对每个 RNA 样本（1 µg 或 10 µL DNase 处理的反应液）进行逆转录，同时应另取一份 1 µg 等分试样用作无 RT 对照。

3.2 对每一样本，混合以下物质：

• 13 µL DEPC 处理过的水
• 16 µL 5X 第一备用缓冲液
• 7 µL DTT (0.1 M)
• 8 µL 随机引物（浓度 = 0.1 µg/µL 或 3 ug/uL 的 1/30 稀释液）
• 8 µL BSA
• 3 µL dNTPs
• 1 µL RNase Out

3.3 上述试剂的总体积为 56 µL。涡旋混合。

3.4 将上述预混液分装到两个 0.5 mL Eppendorf 离心管中，每个离心管 28 µL。一个离心管用于 RT 反应（在该离心管中加入 2 µL MMLV 逆转录酶），另一个离心管用于无 RT 对照，在该离心管中加入 2 µL H₂O。

3.5 在每个离心管中加入 10 µL 上述经过 DNase 处理的 RNA。

3.6 移液混匀。

3.7 所有样本在 37°C 下孵育 1 小时，然后在 95°C 下孵育 5 分钟。后者是为了让剩余的酶（即 MMLV RT 和剩余的任何 DNase）彻底失活。

3.8 立即使用样本进行 PCR，或将样本置于 -20°C 下储存，以备第二天一早使用。

替代步骤：每个样本共计需要 20 µL 不含 RT 的混合液

3.1 从同一组样本中随机选择 2-3 个样本，每个样本取 28 µL 预混液加入至 0.5 mL 试管，然后加入 1 µg RNA，再加入 2 µL DEPC 处理过的 H₂O（可选择加入），用于制备无 RT 对照。

3.2 在剩余的 RT 预混液中加入 MMLV RT（每个样本 2 µL），涡旋混合，然后在每个试管中分装 30 µL 预混液。

• 如果总共有 10 个样本，并且需要逆转录 10 个样本，但是额外需要 2 个或 3 个样本作为无 RT 对照来确定 DNase 处理的有效性。在此情况下，需要制备 7 或 8 倍量的上述预混液。1X 预混液适用于两个样本。
• 如果合计需要 12 次反应（包括 RT 和无 RT 反应），则需要 6X 预混液。

3.3 制作完成后，等分预混液（每个无 RT 样本 28 µL），共两个无 RT 样本，并在预混液中加入 20 µL MMLV RT（2 µL/样本）。涡旋混合，然后分装到 10 个试管中，每个试管 30 µL。向每个试管中加入相应的 1 µg (10 µL) RNA，并按照上述步骤进行孵育。

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