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RNA提取和逆转录实验方案:细胞培养物

​​从培养的细胞中提取RNA 、DNase 处理和逆转录流程

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细胞 RNA 提取流程

1.       使用至少 106 的个细胞,吸出培养基,用预冷的 PBS (1–2 mL) 洗涤一次。

2.       吸出 PBS(尽量吸尽),加入 1 mL TRIzol。

3.       轻轻刮擦培养板,然后用移液器移除 TRIzol,将 TRIzol/细胞裂解物转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。

4.       将样品在室温下放置 5 分钟。

5.       加入 250 μL 氯仿,剧烈振荡样品管约 15 秒。

6.       将样品在室温下放置 5 分钟。

7.       以 10,000 rpm 离心 5 分钟。

8.       此时每个管中分为三层:

上层:澄清水相
中层/中间相:白色 DNA 沉淀
底层:粉色有机相

9.       用移液器小心吸取水相。如果使用较大的枪头,难以控制吸取液体的速度和力度,这会增加吸入部分有机相或 DNA 的可能性。保留一部分水相(DNA 层以上约 1 mm,避免被 DNA 污染)。将吸取的水相置于另一个 1.5 mL Eppendorf 管中。

10.   向水相中加入 550 μL 异丙醇,轻轻混合。将样品在室温下放置 5 分钟。

11.   以最大速度 (14,000 rpm) 离心 20 分钟。如果得率较低,离心 30 分钟。

12.   将样品置于冰上。每个管底应隐约可见一些沉淀物。倒掉异丙醇,加入 1 mL 由 DEPC 水配制的 75% 乙醇。轻轻混合。以 9,500 rpm 离心 5 分钟。

13.   倒掉乙醇,晾干沉淀物。此步骤非常关键:沉淀物过于干燥会导致 RNA 结晶且难以重新溶解;乙醇蒸发不充分也会阻碍 RNA 溶解。倒掉大部分乙醇洗涤液之后,Eppendorf 管底将剩下约 30–40 μL 乙醇。为了加速蒸发,可将管瞬时离心,迫使管壁上的残余液体转移到管底,然后尽量吸除乙醇。当沉淀周围只剩一小块半月形的溶液时,是向 RNA 沉淀中加入 DEPC 水的最佳时机。

14.   向 RNA 沉淀中加入约 15–25 µL(具体取决于得率)DEPC 处理的 TE 缓冲液或 DEPC 水。在 Eppendorf 小管中将 RNA 稀释 40 倍(将 1.2 μL RNA 加入 48.8 μL TE 缓冲液中),然后加入微型比色皿中(光程 = 1 cm)。在 260 nm 下测定吸光度。260/280 比值应大于 1.8。如果该值在 1.5–1.6 左右或更小,表明 RNA 可能已经至少部分降解。如果该值更低,表明存在 DNA 或硫氰酸盐污染。RNA 浓度即为 260 nm 处 OD 值所对应的浓度(单位为 µg/µl)。

组织 RNA 提取流程

此流程与细胞 RNA 提取流程的唯一不同之处在第一步。向无菌培养管(优选 12 × 75 mm)中加入 1 mL TRIzol。向该管中加入冷冻组织(尽量将加入量控制在约 20 mg 以下)。在冰上用匀浆器研磨组织,匀浆器设置为 25/30,总共研磨2 次,每次 10 秒。然后将 TRIzol 溶液倒入 1.5 mL Eppendorf 管,按照上述步骤处理(从第 4 步开始)。

DNase 处理

1.       就每个样品而言,DNase 混合液包括以下体系:

RQ1 RNase-Free DNase:1 μL
DNase 10 × 反应缓冲液:2 µL
DEPC 水:6 µL
RNase Out:0.5 µL

2.       根据要处理的 RNA 样品数量制备上述体系的混合液。

3.       按照以下方法制备 RNA:

在 Eppendorf 小管中加入 2 µg RNA(用 2 µg 除以测得的 RNA 浓度 (µg/µL) 所得的体积)。加入 DEPC 水,使 RNA 的总体积达到 11 μL。例如,如果 RNA 浓度为 1 µg/µL,则向 9 µL DEPC 水中加入 2 µL RNA。

向 RNA 中加入 9 µL DNase 混合液,使总体积达到 20 μL。

4.       此步骤在PCR仪中进行。将样品在 37 ℃ 下孵育 15 分钟,随后在 65 ℃ 下孵育 20 分钟,然后置于冰上。将每个样品瞬时离心,确保所有样品都集中在管底。这种 DNase 处理的 RNA 即可立即用于逆转录反应。

DNase 处理的 RNA 的逆转录

1.       在大多数情况下,用逆转录酶对每个 RNA 样品(1 μg,或 10 μL DNase 处理的反应液)进行逆转录时,都应另取 1 μg 样品用于不添加逆转录酶,作为对照。

2.       就每个样品而言,先混合以下体系:

13 µL DEPC 水
16 µL 5 × 第一链缓冲液
7 µL DTT (0.1 M)
8 µL 随机引物(浓度为 0.1 µg/µL,或将 3 µg/µL 的引物稀释 30 倍)
8 µL BSA
3 µL dNTP
​1 µL RNase Out

上述试剂的总体积为 56 µL。涡旋混合。

3.       将上述预混液分装到两个 0.5 mL Eppendorf 管中,每管 28 μL。一个管用于逆转录反应(向其中加入 2 μL MMLV 逆转录酶),另一个管用于不添加逆转录酶,作为对照(向其中加入 2 µL 水)。

4.       向每管中加入 10 μL 上述经过 DNase 处理的 RNA。

5.       用移液器充分混合样品。

6.       将所有样品在 37 ℃ 下孵育 1 小时,然后在 95 ℃ 下孵育 5 分钟。后一个步骤会使剩余的酶彻底失活(即 MMLV 逆转录酶和剩余的 DNase)。

7.       立即使用样品进行 PCR,或将样品保存于 -20 ℃,以备第二天使用。

8.       也可采用另一种方法:

每个样品需要 20 μL 不添加逆转录酶的混合液。从一组样品中随机选取 2-3 个样品,如下制备所选样品不添加逆转录酶的对照:就每个样品而言,取 28 μL 逆转录预混液至 0.5 mL 管中,然后加入 1 μg RNA 和 2 μL DEPC 水(是否加水可选)。

向剩余的逆转录预混液中加入 MMLV 逆转录酶(每个样品加入 2 μL),涡旋混合,然后每管分装 30 μL 预混液,用于其余每个样品。例如,总共有 10 个样品,所有样品均要进行逆转录,但只需 2-3 个不添加逆转录酶的对照来确定 DNase 处理步骤的有效性。那么,需要制备 7-8 倍量的上述预混液,每单倍量的预混液可用于两个样本。

​也就是说,如果总共需要 12 个反应(包括添加逆转录酶和不添加逆转录酶的反应),那么需要 6 倍量的预混液。制备完成后,先分装两份用于不添加逆转录酶的样品(每份 28 μL),然后向剩余的预混液中加入 20 μL MMLV 逆转录酶(每个样品 2 μL)。涡旋混合,然后分装到 10 个管中,每管 30 μL。向每个管中加入相应的 1 μg (10 µL) RNA,然后按照上述步骤进行孵育。



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