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试剂
1. 1xPBS:商品化
2. RIPA裂解缓冲液:商品化
3. BCA试剂盒:商品化
1. 将细胞培养至90%密度,吸除培养液,用预冷1xPBS轻轻漂洗细胞。
2. 加入3ml预冷1xPBS,将细胞用细胞刮刮下转移至离心管。
3. 用预冷1xPBS洗涤细胞3次,100g-500g离心5min,弃上清。
4. 如样本为组织,将冰冻组织块剪碎,使用组织研磨仪将剪碎的组织块研磨充分。
5. 向细胞或组织碎片中加入5倍体积的RIPA裂解缓冲液。
6. 用移液枪吹打混匀细胞或组织碎片约1min,放置于4℃旋转反应45min。
7. 超声裂解,超声功率40kw,超声时间3s,间隔10s,超声25-30次,直至细胞团块或组织碎片全部打散,裂解液清亮。
8. 15000g-17000g离心5-10min,取上清,弃沉淀。
9. 用BCA试剂盒测定蛋白浓度,并用RIPA裂解缓冲液调整蛋白浓度至4mg/ml。
10. 分装裂解液,保存于-80℃。