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蛋白质印迹(Western blot)对照推荐

想优化您的蛋白质印迹实验吗?阅读本文了解关于蛋白质印迹推荐对照的信息。

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​​阳性对照裂解物

阳性对照裂解物是来源于已知表达检测蛋白的细胞系或组织样品的裂解物。如果阳性对照的结果呈阳性,即使样品呈阴性,也能说明流程的优化性和可行性。阳性结果可证明任何阴性结果的有效性。

我们推荐查看抗体数据表,数据表通常会提供建议的阳性对照。始终确保所用组织或细胞系来源于测试物种。并非所有数据表都附有建议的合适对照,在这些情况下我们进行如下推荐:

  •  查看是否有关于该抗体的 Abreview。客户成功使用过的任何组织、细胞或裂解物均可视为合适的阳性对照。
  •  试着查看数据表上的 Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库链接。这些数据库通常会列出表达有该蛋白质的组织。这些也可视为合适的阳性对照。
  •  查看该蛋白质的 GeneCards 条目。GeneCards 通常会提供不同组织中的相对表达水平。
  •  如果仍然难以找到合适的对照,我们推荐在 PubMed 上快速搜索相关文献,查看哪些组织和细胞表达目标蛋白质。


阴性对照裂解物

阴性对照裂解物是来源于已知不表达检测蛋白的细胞系或组织样品的裂解物。使用阴性对照的目的是检查是否存在非特异性结合和假阳性结果。


上样对照

上样对照是管家蛋白的抗体,也可以是在几乎所有组织和细胞中表达水平相当的蛋白质。

使用上样对照的目的在于:

  •  确保凝胶中的所有泳道含有等量的样品。这有助于研究人员确认目标蛋白的差异并非由凝胶上样过程中的操作失误造成。
  • 估量样品中的蛋白质量。确保蛋白质印迹流程中发生了从凝胶到膜的转移。

查看上样对照。


内源性对照裂解物

如果您正在测试重组蛋白质样品,我们推荐加上内源性对照。这应是实验计划的重要部分。

抗体检测重组蛋白质时,存在难以克服的困难,有必要加以考虑。重组蛋白质的折叠形式可能不同于其内源性天然形式,并且可阻止抗体接近表位。标签蛋白质的情况尤其如此。

确保标签始终位于重组蛋白的 N 端或 C 端。最重要的是,应始终确保重组蛋白质包括所用抗体的免疫原序列。内源性阳性对照对于验证结果以及说明试剂(例如抗体)和流程的效果如何是非常重要的。


无一抗对照

无一抗对照是膜的一条带中未加入一抗的对照。只向其中加入二抗。无一抗对照指示是否存在由于二抗的非特异性结合而造成的任何非特异性结合或假阳性。

在实验流程的这一步,用不含抗体的抗体稀释缓冲液替代一抗溶液。在样品上正常孵育二抗。

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