诱导 MMP-9 表达protocol

使用 PMA 诱导细胞系中 MMP-9 的表达，并制备用于后续实验的裂解液。

在许多细胞系中，MMP-9表达水平低。但是，当使用PMA（蛋白激酶 C 的一种配体）刺激细胞可以显著诱导 MMP9 表达¹。为了检测到细胞系中的 MMP-9信号来进行分析，可能需要首先用 PMA 刺激细胞。

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​​使用 PMA 刺激细胞

该方案针对 U937 细胞进行了优化。

1. 使用含 2 mM 谷氨酰胺和 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 1640 培养基， 37℃ 培养细胞。

2. 当细胞培养密度达到 0.5-1 x 10⁶ 个细胞/mL 时，将 20 mL (2 x 10⁷) 细胞转移至新的培养皿中，并加入 PMA 至终浓度 10 ng/mL。

3. 37℃ 孵育 21 h ，然后加入布雷菲德菌素 A（Brefeldin A）至终浓度3 µg/mL，再孵育 3 h。布雷菲德菌素 A 处理细胞可抑制蛋白分泌。

4. 离心收集细胞，并使用 PBS 清洗。

5. 用液氮速冻细胞。                                                                                             

           细胞可在 -80℃ 下保存，或立即裂解进行WB分析。

细胞裂解

1. 向细胞团块中加入 300 µL 预冷的裂解缓冲液，并重悬细胞。​如果细胞仍然聚集在一起，涡旋震荡试管​ 10 s，在冰上静置 3 min，并再次尝试重悬。
2. ​​冰上静置 10 min，然后吹吸细胞进行重悬。​​

3. 超声处理，3次40 s，如果细胞团块仍然可见，重复超声处理。裂解液为淡黄色则裂解良好。

4. 离心裂解液，8000 rcf 离心10 min，4°C，沉淀细胞碎片。

5. 转移上清液至新试管中，注意不要转移任何细胞碎片。

            裂解液既可以在 -80℃ 下保存，也可以立即用于 WB 分析。

裂解缓冲液

​使用前加入蛋白酶抑制剂。

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参考文献

​Roomi MW, Monterrey JC, Kalinovsky T, Rath M, Niedzwiecki A. Patterns of MMP-2 and MMP-9 expression in human cancer cell lines.Oncol Rep. 21, 1323-1333 (2009).