自然染色质免疫沉淀方案 (N-ChIP)

ChIP 的详细程序和提示。

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从培养的人体细胞中制备天然染色质

所有溶液都需要是冰冷的。

含蔗糖的溶液必须在当天新鲜配制。

使用前，在所有裂解液中加入蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSAF 和完整的小型蛋白酶抑制剂；市售）。

更多 ChIP 资源和产品

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- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质

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1. 培养细胞（例如 HL-60 或淋巴母细胞）生长至密度约为 1 × 106 个细胞/ml，直至处于对数生长期。
2. 收获细胞：离心样品 (1,000 g，10 分钟，4°C)，冰冷 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤细胞沉淀 3 次。​
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   当使用乙酰化组蛋白抗体阻止去乙酰化时，在整个染色质分离过程中，5 mM 的丁酸钠有必要存在于所有的溶液中。
   
   

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3. 以 2 × 107 个细胞/ml 重悬细胞沉团于 TBS（Tris 缓冲盐水）中，加入等体积 1.0% v/v Tween 40 的 TBS 溶液。加入 PMSF 至终浓度为 0.5 mM。在冰上轻轻搅拌 1 小时（用小磁棒或跳蚤将混悬液转移至 50 mL 试管中；将试管置于磁力搅拌器顶部的冰上）。
4. 将细胞裂解液转移到全玻璃匀浆器中，用“A”或“紧密”研杵研磨 7 次，每次研磨 7 mL 等分试样。用相差显微镜检查细胞核是否已释放；完整的细胞应该有细胞核中央的暗区，周围有晕圈，晕圈是密度较低的细胞质。​

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   您可能需要增加或减少该均质化步骤，以根据细胞系实现细胞核产量最大化。在各轮同质化之间将细胞置于冰上。
   
   

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5. 离心样品 (8,000 g，20 分钟，4°C)。
6. 用 25% [w/v] 蔗糖/TBS（4 × 106 个细胞核/ml）重悬细胞核团块，并用 0.5 vol 的 50% [w/v] 蔗糖/TBS 垫底；离心样品 (10 000 g，15 分钟，4°C)。
7. 丢弃上清液，用 5 mL 25% [w/v] 蔗糖/TBS 洗涤细胞核团块；离心样品 (10,000 xg，15 分钟，4°C)。

8. 用 5 mL 消化缓冲液重悬细胞核团块，检查细胞核混悬液稀释样品在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度比值；根据 A260 读数计算近似 DNA 浓度（A260/A280 的比值应约为 1.1）。

   染色质产量 (µg) 表示为：A260 × 稀释因子 × 体积 × 50。离心样品 (10,000 rpm，10 分钟，4°C)，在 1.7 mL Eppendorf 管中以 0.5 mg/mL 重悬细胞核团块。如有必要，分成 1 mL 等分试样。

微球菌核酸酶消化

通常，我们在 1.0 mL 反应体积中按每 0.5 mg DNA 加入 50 U 微球菌核酸酶的标准添加微球菌核酸酶。微球菌核酸酶通常以粉末形式提供；将微球菌核酸酶溶于 dH20，直至所需浓度，小份储存于 -20°C 条件下，可再次冷冻并重复使用一次。这个步骤需要小心控制，特别是在最初的准备工作中。

高浓度的微球菌核酸酶可能过度消化染色质，产生亚核小体颗粒。您的目标应为获得长/中寡核苷酸体梯形。如果需要制备纯的单核小体，需进行线性蔗糖梯度离心 (5-20%)，这将提高分离度。

1. 在 37°C 条件下进行 microccal 核酸酶消化 5 分钟。
2. 加入 0.2 M EDTA，直至终浓度达到 5 mM，终止反应。
3. 将所有样品置于冰上 5 分钟；离心样品（12,000g，5 分钟）。
4. 取出并保留第一个 S/N（称为 S1 部分；总体积 1.0 mL）；4°C 保存过夜。
5. 用 1.0 mL 裂解缓冲液重悬团块，用 2 l 相同缓冲液透析过夜。
6. 过夜透析后离心样品 (1,800 g，10 分钟，4°C)。
7. 去除并保存上清液（称为 S2 部分；透析后总体积约 1.2 mL）；4°C 保存。
8. 用 200 μL 裂解缓冲液（称为 P 组分）重悬不溶性沉淀物质。
   
   

可溶性染色质组分分析

1. 检查所有样品中的 A260/A280；S1、S2 和 P 组分的比值分别约为 1.7、1.5 和 1.3。通过 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析所有样品。​
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   不得将溴化乙锭置于琼脂糖凝胶或电泳缓冲液中，因为存在 SDS（见下文）。
   
   

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   样品制备：x μl（总共 5 μg）染色质组分（S1、S2 和 P）、yμl dH2O (x + y = 25 μL)、3 μL 1% [w/v] SDS（最终浓度 0.1%）、2 μL 凝胶上样缓冲液（含溴酚蓝）。
2. 运行结束后，用 0.5 μg/mL 溴化乙锭对凝胶进行染色。
   
   

免疫沉淀

1. 100-200 μg 未固定染色质 + 100-200 μL 亲和纯化抗体 (50-100 μg Ig)，用孵育缓冲液补足至 1.0 mL。还需要设置阴性对照（未添加抗体），以检测染色质与蛋白 A 琼脂糖凝胶的非特异性结合。
2. 4°C 下，在缓慢旋转转盘上孵育过夜。加入 200 μL 50% v/v 蛋白 A 琼脂糖凝胶；使用硅化移液器，切掉吸头，使该步骤更容易。室温下在快速旋转转盘上孵育 3 小时。（确保琼脂糖始终处于混悬液中）。
3. 离心样品 (2,000g，10 分钟，4°C)，取出并保持 S/N；此为未结合（或“U”）组分。
4. 用 1 mL 缓冲液 A 重悬琼脂糖凝胶沉淀，用硅化巴斯德吸管和硅化 15 mL 管分层混悬在 9 mL 相同缓冲液中。
5. 离心样品 (2,000 g，10 分钟，4°C)，弃去 S/N，依次在 10 mL 缓冲液 B 和缓冲液 C 中清洗琼脂糖凝胶。
6. 最后，将琼脂糖重悬于 1 mL 缓冲液 C 中，并移回硅化 Eppendorfs 中。
7. 离心样品 (2,000 g，10 分钟，4°C)，用 250 μL 1.0% SDS/孵育缓冲液重悬琼脂糖团块，在快速转盘上室温孵育 15 分钟。（确保琼脂糖始终完全重悬）。
8. 离心样品（2,000g，10 分钟，4°C），取出并保存 S/N；此为结合（或“B”）组分。

9. 用 250 μL 1.0% SDS/孵育缓冲液清洗琼脂糖凝胶，并立即离心（2,000 g，10 分钟，4°C）。去除 S/N 并与上一步得到的先从结合组分合并存放。

DNA 分离

在各结合组分中加入 500 μL 孵育缓冲液，以将 SDS 浓度降低至 0.5% SDS。然后按照以下方法处理未结合和结合组分：

1. 加入 0.33 vol (330 μL) 苯酚/氯仿；涡旋离心（13000 rpm，10 分钟，微量离心机）。保留有机相和界面；用于分离免疫沉淀蛋白（见下文）。
2. 将水性上清液转移至等体积 (1.0 mL) 酚/氯仿中；涡旋离心（13000 g，10 分钟，微量离心机）
3. 移取上清液至等体积 (1.0 mL) 氯仿中；涡旋离心（13,000 g，10 分钟，微量离心机）
4. 转移 S/N 至洁净离心管中，加入 0.1 vol (100 μL) 4 M 氯化锂、50 μg 糖原（分子生物学级，溶于 2 mg/mL 的 dH20）作为载体和 4 vol 乙醇。充分涡旋，-20°C 下放置过夜。
5. 离心样品（13000 g，15 分钟）以沉淀 DNA。
6. 用 70% 乙醇（分子生物学级）清洗沉淀，将 DNA 重新溶解于 250 μL TE 缓冲液中。
7. 将样品保存在 -20°C 条件下或继续用检测方法（PCR、微阵列等）进行检测。
8. PCR 用于定量特定基因位点的 DNA 水平。使用可使用该工具设计的引物进行半定量分析（通过琼脂糖凝胶分析 PCR 最终产物）。

或者，通过实时 PCR 定量测定 DNA 水平。引物和探针通常使用实时 PCR 仪提供的软件设计。

蛋白质分离

1. 在第一个苯酚/氯仿相（参见 DNA 分离；步骤 1）中加入 5 μL 1 mg/mL BSA 溶液（用作载体）、0.01 vol (4 μL) 10 M H2SO4 和 12 vol 丙酮。
2. -20°C 下过夜沉淀后，在酸化丙酮（1:6 100 mM H2SO4:丙酮）中洗涤蛋白团块 1 次，在干燥丙酮中洗涤 3 次。可通过 SDS-PAGE 分析蛋白质。
   
   

溶液

10 × TBS

0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)

1.5 M 氯化钠

30 mM 氯化钙

20 mM 氯化镁

50 mM 丁酸钠 (pH 8.0)

消化缓冲液

0.32 M 蔗糖

50 mM Tris-HCl (pH 7.5)

4 mM 氯化镁

1 mM 氯化钙

0.1 mM PMSF

5 mM 丁酸钠

裂解缓冲液

1.0 mM Tris-HCl (pH7.4)

0.2 mM 乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)

0.2 mM PMSF

5 mM 丁酸钠

孵育缓冲液

50 mM 氯化钠

20 mM Tris-HCL (pH 7.5)

20 mM 丁酸钠

5 mM 乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)

0.1 mM PMSF

缓冲液 A

50 mM Tris-HCl, (pH 7.5)

10 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

5 mM 丁酸钠

50 mM 氯化钠

缓冲液 B

50 mM Tris-HCL (pH 7.5)

10 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

5 mM 丁酸钠

100 mM 氯化钠

缓冲液 C

50 mM Tris-HCL (pH 7.5)

10 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

5 mM 丁酸钠

150 mM 氯化钠

蛋白 A 琼脂糖凝胶

​4°C 下，在缓冲液 A 中预溶胀蛋白 A 琼脂糖凝胶过夜。离心（10,000 xg，10 分钟）并在大约等体积 (50% v/v) 缓冲液 A 中重悬沉淀物。

• （摘自 Laura O’Neill 和 Bryan Turner 教授使用的方案。伯明翰大学）

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