All tags IHC protocols ISH:原位杂交实验方案

ISH:原位杂交实验方案

抗体检测原位杂交的一般实验步骤和实验技巧。

原位杂交可指示基因在细胞环境中的表达位置。研究人员可使用带标记的 RNA 或 DNA 探针与样品中已知的靶 mRNA 或 DNA 序列杂交,然后利用抗体检测探针上的标记检出这些带标记的 RNA 或 DNA 探针。因此,这些探针可用于检测目标基因的表达水平和 mRNA 的位置。

打印此ISH实验方案。

您也可以通过手机访问 Abcam App 获取我们最常用的实验方案,Abcam App 可提供多种实验方案、技术支持和实用工具,方便现场科研工作者随时随地访问。更多信息



​样品保存


RNA 保存

RNase 酶的存在使 RNA 保存变得困难。此酶广泛存在于玻璃器皿上、试剂中以及操作人员身上及衣服上。RNase 可迅速破坏细胞中的 RNA 及 RNA 探针本身,因此用户的实验过程、手套和溶液需要保证无菌,防止探针或组织 RNA 受到 RNase 的污染。

冷冻切片的一般样品保存

为了使保存的载片获得最佳结果,请勿将载片在室温环境下干燥保存。正确方法是,将其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存,或将其用莎伦包装膜覆盖的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C条件下保存。这种保存方法可使载片保存数年。



探针选择


RNA 探针

RNA 探针长约 250–1500 个碱基;长度为800 个碱基左右的探针具有最佳灵敏度和特异性。转录模板应支持探针(反义链)和阴性对照(正义链)RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探针之前,必须对环状模板进行线性化,但也可使用 PCR 模板。

DNA 探针

DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比, DNA 探针与靶 mRNA 分子的杂交强度较弱,因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。

探针特异性至关重要。如果已知细胞中 mRNA 或 DNA 的确切核苷酸序列,则可据此设计高度精确的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补,那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着,探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去,可能无法正确检测。



地高辛 (DIG) 标记 RNA 探针原位杂交实验方案

此方案介绍了如何使用 DIG 标记的 RNA单链 探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。

1) 脱蜡

对于冷冻切片,请从第 2 步开始操作。如果使用甲醛固定的石蜡包埋切片,请继续此步骤。

首先,必须对载片进行脱蜡和复水操作。如果石蜡去除不完全,则会导致切片的染色效果较差。

将载片置于支架上,然后执行以下洗涤操作:

  • 二甲苯:2x3 分钟
  • 1:1 的二甲苯和 100% 乙醇:3 分钟
  • 100% 乙醇:2x3 分钟
  •  95% 乙醇:3 分钟
  • 70% 乙醇:3 分钟
  • 50% 乙醇:3 分钟
  • 使用冰冷的自来水清洗

抗原修复步骤之前将载片置于自来水中。从这一步开始,不能使载片干燥,因为干燥会导致非特异性抗体结合和高背景染色。

2) 抗原修复

将含 20 µg/mL 蛋白酶 K 的 50 mM Tris 预热并在 37 °C条件 下孵育酶解 10–20 分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓度可能需要根据实际情况优化。

我们建议通过蛋白酶 K 滴定实验来确定最佳条件。酶解不充分会导致杂交信号降低,过度酶解会影响组织形态,给杂交信号的定位带来极大困难。蛋白酶 K 的最佳浓度会随组织类型、固定时间和组织大小而发生变化。

3) 使用蒸馏水清洗载片 5 次。

4) 将载片浸入预冷的 20% (v/v) 乙酸中 20 秒。这样可使细胞通透化,使探针或抗体能够透过。

5) 分别使用 70% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇洗涤载片(每次约 1 分钟)使其脱水,然后风干。

6) 向每个载片中加入 100 µL 杂交液。


试剂

终浓度

每 1 mL 溶液的使用量

甲酰胺

50%

500 µL

5x

250 µL

丹哈德溶液

5x

50 µL

硫酸葡聚糖

10%

100 µL

肝素

20 U/µL

10 µL

十二烷基硫酸钠

0.1%

1 µL

盐溶液 (20x)

  •   4 M NaCl
  •  100 mM EDTA
  •   200 mM Tris-HCl pH 7.5
  •  100 mM NaH2PO4.2H2O
  •  100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

  •  10 g 聚蔗糖
  •  10 g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)
  •  10 g 牛血清白蛋白 (BSA)
  •   500 mL 无菌 dH2O


7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育 1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。

8) 在PCR 管中用杂交液稀释探针。利用PCR仪在 95 °C条件下加热RNA 或 DNA 2 分钟,使其变性。然后立即将探针置于冰上冷却,以防止重退火。

9) 除去杂交液。向每个切片加入 50–100 μL 探针稀释液,覆盖整个样品。在 65 °C 条件下在增湿的杂交盒中孵育过夜。用盖玻片盖住样品,以防样品蒸发。

在此步骤中,RNA 探针会与相应的 mRNA 杂交,或 DNA 探针会与相应的细胞 DNA 杂交。杂交温度的优化取决于所用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。

探针的最佳杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。

10) 严格洗涤

通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。

配制 1 L 20x 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)

  • 175.3 g 氯化钠 (3 M)
  • 88.2 g 柠檬酸钠
  • 800 mL 无菌
  •  使用柠檬酸将 pH 调节为 5,定容至 1 L 并使用高压灭菌器进行灭菌处理


洗涤 1

  •  50% 甲酰胺的 2x SSC
  •   3x5 分钟,37-45 ℃

在较高温度(高达 65° C)下短时间洗涤,洗去多余的探针和杂交缓冲液。如果洗涤时间过长,则会洗掉大量的杂交探针 RNA/DNA。

洗涤 2

  •   0.1–2x SSC
  •   3x5 分钟,25-75 ℃


此步骤会消除非特异性和/或重复性 DNA/RNA 杂交。

按照以下说明对严谨洗涤的温度和盐浓度进行优化:

·         对于极短的 DNA/RNA 探针 (0.5–3 kb) 或极为复杂的探针,洗涤温度应更低(最高 45 °C)且严格度更弱 (1–2x SSC)。

·         对于单基因座或较大的探针,温度应在 65 °C 左右且严格度应较强(低于 0.5x SSC)。

·         对于重复性探针,温度应达到最高且严格度应达到最强(例如 α-卫星重复序列)。

11) 在室温下使用 MABT(含 Tween 20 的马来酸缓冲液)洗涤两次,每次 30 分钟。MABT 的性质比 PBS 更温和,更适用于核酸检测。

配制 5x MABT 母液

  •    58 g 马来酸
  •    43.5 g NaCl
  •    55 g Tween-20
  •   900 mL 水

添加三羟甲基氨基甲烷,将 pH 调节至 7.5。大约需要 100 g 三羟甲基氨基甲烷。定容至 1 L。

12) 干燥载片。

13) 将其转移至增湿盒中,向每个切片加入 200 µL 封闭缓冲液(MABT + 2% BSA,牛奶或血清)。在室温下封闭 1–2 小时。

14) 去除封闭缓冲液。将抗标记抗体以所需稀释度加入封闭缓冲液。查看抗体说明书中推荐的浓度/稀释度。在室温下孵育 1–2 小时。

15) 在室温下使用 MABT 洗涤载片 5 次,每次 10 分钟。

16) 在室温下使用预染色缓冲液(100 mM Tris pH 9.5,100 mM NaCl,10 mM MgCl2)洗涤载片 2 次,每次 10 分钟。

17) 如需进行荧光检测,请跳至第 18 步。对于其他形式的检测,请将载片放回增湿盒中,然后依照厂家说明书使其显色。

18) 使用蒸馏水清洗载片。

19) 将载片风干 30 分钟。然后使用 100% 乙醇进行洗涤,并将其彻底风干。

20) 使用 DePeX 封片溶液进行封片。



其它有用资源

注册