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间接 ELISA 实验方案

​​需要偶联二抗的 ELISA 实验的一般步骤和提示。

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缓冲液和试剂

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要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性。

一般步骤

将抗原包被到微孔板

  1. 将抗原在 PBS 或其它碳酸盐缓冲液中稀释至 20 µg/ml 。移取 50 µl 抗原稀释液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使该微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上进行梯度稀释。


    通常将含纯抗原的试样以低于 2 µg/ml 的浓度加到微量滴定板上。纯溶液不是必需的，但是原则上，试样中超过 3% 的蛋白质应为靶蛋白（抗原）。抗原蛋白质浓度不应超过 20 µg/ml，因为这将使微量滴定板上的大部分可用位点饱和。

    确保样品所含抗原的浓度在抗体检测范围内。

  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时，或在 4℃ 下孵育过夜。包被孵育时间可能需要某些优化。
  3. 弃包被液，并在微孔中加入 200 µl PBS，洗涤微量滴定板三次。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。


封闭

  1. 每孔添加 200 µl 封闭缓冲液，即 5% 脱脂奶粉或 5% 血清/PBS，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。替代封闭剂包括 blockACE 或 BSA。
  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 2 小时，或如更方便的话，则在 4℃ 下孵育过夜。
  3. 用 PBS 洗涤微量滴定板两次。


一抗和二抗孵育

  1. 向每个孔内加入 100 µl 的一抗稀释液。
  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。


    此孵育时间可能需要优化。2 小时通常足以获得强信号，但如若获得弱信号，则当在 4℃ 下孵育过夜时往往会观察到更强的染色。

  3. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。
  4. 添加 100 µl 的偶联二抗，其在使用前便已在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度（依照制造商说明书）。
  5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 小时。
  6. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。


检测

虽然已使用许多不同类型的酶来检测，但是辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 测定中广泛使用的两种酶。某些生物材料具有高水平内源酶活性（例如肺泡细胞中的高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶），考虑到这一事实是非常重要的，因为这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。

ALP 底物
pNPP（对硝基苯磷酸盐）是大多数应用最常用的底物。室温孵育 15-30 分钟后，可在 405 nm 处测定硝基苯酚呈现的黄色。（该反应可通过添加等体积的 0.75 M NaOH 终止）。

HRP 显色液
HRP 的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。

TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)
将 TMB 溶液添加到每个孔，孵育 15-30 分钟，添加等体积的终止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 处读取光密度。

OPD (o-邻苯二胺二盐酸盐)
​​在 492 nm 下测定终产物。注意：底物对光敏感，应存放在暗处。

ABTS （2,2’-联氮-双-[3-乙基]-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐。
终产物为绿色，可在 416 nm 处测定 O.D 值。


某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此始终要小心处理并佩戴手套。

  1. 使用多道移液器或多档移液器为每孔分配 100 µl（或 50 µl）底物溶液。 
  2. 待显色充分后（如有必要），将 100 µl 终止液添加到微孔。
  3. 用酶标仪读取每孔的吸光度（光密度）。


数据分析

根据系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴（对数标度）上，而吸光度标在 Y 轴（线性标度）上。通过标准曲线来计算出样品的浓度。

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