免疫沉淀疑难排除技巧
本文详细阐释了免疫沉淀（IP）实验中疑难排除技巧，如高背景或洗脱液中大量目标蛋白等。
高背景
不溶于溶剂的蛋白质的遗留物
离心后立即移除上清液，这样不溶性蛋白质将会留在离心颗粒中。如果颗粒物发生再悬浮，再次离心即可。
不完全清洗
在离心前，将盖子盖在试管上并倒置几次，在相关阶段充分冲洗。
非特异性蛋白质与磁珠结合
BSA没有预封闭全部的磁珠。确保BSA（组分V）是新鲜的，用1%的BSA在PBS中孵育1小时。磁珠在使用前须在PBS中清洗3-4次。
使用的抗体含有不够特异的抗体
使用亲和纯化的抗体，最好是经预吸附的抗体。
使用过多抗体导致非特异性结合
查看推荐的抗体量。尽量少用抗体。
细胞过多或裂解液中蛋白质过多导致洗脱液中含大量非特异性蛋白质
减少使用的细胞或裂解物的量。我们建议使用10-500µg细胞裂解物。
抗体与蛋白质的非特异性结合
如果有许多非特异性结合的蛋白质，那么试着减少添加到磁珠的样本量。在开始免疫沉淀之前，您也可以通过将准备好的裂解液与磁珠预孵育来预清理裂解液（请参考实验流程），此步骤可清除任何非特异性结合到磁珠上的蛋白质裂解物。一些研究人员还使用来源于同一物种的同一免疫球蛋白亚类的不相关抗体来预清理裂解物。
免疫沉淀过程中的抗原降解
确保细胞裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂。
大量抗体洗脱
与靶蛋白一起洗脱的抗体过多
可以尝试减少抗体的量。在免疫沉淀前将抗体与磁珠交联，并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱，如此可显著减少洗脱的抗体量。
未检测到洗脱靶蛋白
所用样本中未表达靶蛋白/所用样品中靶蛋白表达水平低
检查表达谱，确保靶蛋白在样本细胞中表达。如果靶蛋白表达水平较低，则增加所用裂解物的量。当然，这也可能导致非特异性结合增加，因此建议在开始免疫沉淀之前预先清除裂解物。
抗体量不足以捕获靶蛋白
检查是否使用了推荐量的抗体。可能需要增加抗体浓度以优化结果。
靶蛋白没有从磁珠中洗脱出来
确保您使用了正确的洗脱缓冲液，并且该缓冲液的浓度和pH值正好适合洗脱靶蛋白。
抗体未与免疫吸附珠结合
确保所使用的磁珠与抗体的类型相匹配。
使用错误的裂解缓冲液
查看说明书以确定使用的抗体是用来检测变性蛋白的还是天然蛋白，并确保使用了正确的裂解缓冲液。参考我们的免疫沉淀实验方案。
靶蛋白被抗体重链或轻链阻断
二级抗体识别在免疫沉淀过程中释放的变性/还原的一级抗体或内源性IgG
使用二级抗体做Western Blot，以检测免疫沉淀样本中的一级抗体的重链和轻链，实验结果总会是两条带（50kDa的重链和25kDa的轻链）。
为了避免抗体亚链的干扰，我们建议使用二级抗体，如免疫沉淀的VeriBlot，它能特异识别天然（非还原）一级抗体。