IHC组织处理方案

​组织经脱水、透明，然后浸包埋剂，以进行切片。石蜡是免疫染色的最常见包埋剂。

石蜡组织处理

1. 组织固定后，用 PBS 冲洗至完全去除固定剂。 
2. 按照下列顺序使用乙醇脱水组织：​

   溶液	孵育时间
   50% 乙醇	10 分钟
   70% 乙醇	10 分钟
   80% 乙醇	10 分钟
   95% 乙醇	10 分钟
   100% 乙醇	10 分钟
   100% 乙醇	10 分钟
   100% 乙醇	10 分钟

3. 按以下顺序将乙醇置换成二甲苯：​

   溶液	孵育时间
   乙醇 : 二甲苯为：2 : 1	10-15 分钟
   乙醇 : 二甲苯为：1 : 1	10-15 分钟
   乙醇 : 二甲苯为：1 : 2	10-15 分钟
   100% 二甲苯	10-15 分钟
   100% 二甲苯	10-15 分钟
   100% 二甲苯	10-15 分钟

4. 用石蜡置换二甲苯。以下步骤在 54°C -58°C 的真空烘箱中完成。可以使用 Paraplast X-tra™ 或 Paraplast Plus™（后者添加 DMSO 以促进浸蜡）。石蜡温度不应长时间超过 60°C，这会使石蜡聚合物降解而变硬变脆。

   ​溶液	孵育时间
   二甲苯 : 石蜡为：2 : 1	30 分钟
   二甲苯 : 石蜡为：1 : 1	30 分钟
   二甲苯 : 石蜡为：1 : 2	30 分钟
   100% 石蜡	1 至 2 小时
   100% 石蜡	1 至 2 小时或过夜

5. 组织浸入新鲜的新石蜡中，并在其硬化之前根据需要定向（胚胎垂直放置）。

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包埋冷冻组织

1. 准备处理的组织应进行固定并储存在 PBS 中。
2. 蔗糖浸透。​

   溶液	孵育时间
   10% 蔗糖	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   10% 蔗糖:30% 蔗糖为：2 : 1	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   10% 蔗糖:30% 蔗糖为：1 : 1	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   10% 蔗糖:30% 蔗糖为：1 : 2	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   30% 蔗糖	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   30% 蔗糖	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部
   30% 蔗糖	15 分钟 或直到样本落至小瓶底部

• 使用干冰部分填充干冰容器，加入甲醇制成冰浴，静置。
• 用每个动物的编号标记 TissueTek 孔，并填充 OCT 包埋剂 (optimal cutting temperature compound, OCT) ((TissueTek) 冷冻化合物。
• 在实验室清理组织器械（如 Kimwipes™）上吸干组织中多余的蔗糖，并将组织置于填充有 OCT 的孔中心。
• 将组织在孔底定向放置，使其漂浮在甲醇冰浴中冷冻。​
  
  

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  注意：不要将甲醇添加到 OCT 中，这将无法适当冷冻。
  
  

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• 将冷冻的组织块在冷冻后放入 -20°C 的冰柜中保存。
• 组织块完全冷冻后即可切片。​
  
  

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  不要在冷冻机中储存载玻片过夜，因为载玻片会变干并且影响后续工作。最好是将所有组织装入塑料袋后再放入-20°C 的无霜冰柜中，以减少储存过程中出现干燥的情况。
  
  

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• 在冷冻机上切片。
  
  

 乙二醇甲基丙烯酸酯 (Glycol methacrylate, GMA) 包埋

使用 GMA 的优点

• 与水互溶，无需脱水和再水化步骤。
• 染色前无需清除树脂。
• 粘度低，易渗透组织。
• 无交联，无抗原修复。
• 抗原呈递作用好。
• 形态保存良好（细胞定位）。
• 低温处理。
• 可以切成非常薄的切片（1-2 μm），使得大部分小活检标本也可获得较好的分辨率。

固定

多种组织均可采用 GMA 法固定。

通常，在丙酮中固定效果更好。使用以下方法：

1. 立即将活检标本置于冰冷的含有蛋白酶抑制剂的丙酮中。
2. 在 -20°C 下固定过夜。
3. 用丙酮替换固定剂（室温下）15 分钟。

​处理

1. 活检标本放置在苯甲酸甲酯中 15 分钟（有助于 GMA 浸透组织）。
2. 将活检标本置于 5% 苯甲酸甲酯的 4°C GMA 中。
3. 用新鲜溶液再重复处理两次。

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包埋

按照试剂盒生产商的说明包埋 GMA。GMA 需要使用催化剂（市售试剂盒中提供）进行聚合，并在 4℃ 下放置 48 小时。

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