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IHC固定实验方案

IHC固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。此实验方案将指导您完成固定过程。

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简介

固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。固定方法的选择取决于表位和抗体本身的灵敏度,并且可能需要一些优化。

我们可使用交联剂(例如多聚甲醛)进行固定。交联剂更有利于保持细胞结构,但可能降低某些细胞组分的抗原性,因为交联会阻断抗体的结合能力。此时可能需要进行抗原修复,特别是固定时间较长或使用较高浓度的交联固定剂时。



​细胞培养样品的固定方法


​福尔马林

  •  向玻片中加入 10% 中性福尔马林缓冲液 (NPF),静置 10 分钟,
  •  然后用 PBS 洗涤 3 次。

如果在福尔马林中固定 10-15 分钟以上,则蛋白质的交联程度将升高并需要进行抗原修复,以确保抗体能自由接近蛋白质,达到结合和检测目的。

乙醇

  •  向每个玻片中加入 100–200 μL 95% 乙醇、5% 冰醋酸。
  •  在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟,最好置于 Coplins 瓶中,
  •  然后用 PBS 洗涤 3 次。

甲醇

  •    向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的甲醇、5% 醋酸。
  •    在 -20 ℃ 放置 10 分钟,最好置于 Coplins 瓶中,
  •    然后用 PBS 洗涤 3 次。

乙醇和甲醇会使细胞通透化。某些抗原表位对甲醇极为敏感,因为甲醇可能会破坏表位结构。如果出现这种情况,在需要通透化时,可尝试使用丙酮代替甲醇。

丙酮

  •    向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的丙酮。
  •    在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟,
  •    然后用 PBS 洗涤 3 次。

丙酮也会使细胞通透化,因此不需要额外的通透化步骤。



组织样品的固定方法

浸泡固定

最常使用 10% 中性福尔马林缓冲液 (NBF)。如果数据表中说明了 IHC-P 是经测试的应用,那么除非另有说明,否则均使用此固定剂。其它固定剂的使用频率较少,例如 Bouin 溶液(多聚甲醛/苦味酸)。

理想的固定时间取决于组织块大小和组织类型,但 18-24 小时的固定时间适用于大部分应用。固定不足可能导致边缘染色,即切片边缘具有强信号而中间没有信号。固定过度可能会掩盖表位;抗原恢复可帮助克服此问题,但如果组织的固定时间过长(即超过两天),那么即使进行抗原恢复也可能没有信号。

灌注固定

对于小组织来说,浸入固定溶液通常能获得足够的固定。但是,如果将固定溶液经由内循环系统(无论是通过心脏或通过腹主动脉)灌注,则往往能获得更快速、更均匀的固定。下文介绍了使用 4% 多聚甲醛固定大鼠的大部分器官的实验步骤。

灌注固定中使用的试剂和器具

  • 麻醉剂
  • 手术用剪刀、镊子和夹钳
  • 带精细齿纹的小镊子
  • 手术刀
  • 带盖的样本瓶 (5–10 mL)
  •  0.9% 生理盐水
  •  500 mL 烧杯
  • 4% 多聚甲醛,固定溶液
  • 手套、护目镜
  • 灌注泵(或置于手术台上方约 150 cm 的倒置烧瓶,内装有固定剂)
  • 用于心脏主动脉灌流的带针头短注射器,长度约 50 mm,外径 1.3-1.5 mm
  • 带滴注器的灌注套件,类似于静脉输血用品


通过心脏灌注固定

  1. 安装灌注泵;连接灌注套件和灌注针。首先,用约 100 mL 自来水冲洗管道,去除管道中的任何残留物。然后,将灌注管的开口末端放入盛有冷的 4% 多聚甲醛的烧杯(置于冰盒中)中。溶液体积应与动物体重成比例,通常一只动物使用 200-300 mL 固定液已足够。打开阀门,将滴速调整到缓慢、稳定的速度 (20 mL/min),然后关闭阀门。
  2. 做好手术准备,放置好剪刀、镊子和夹钳。向动物注射适当剂量的麻醉剂。动物麻醉后,将其面朝上放在手术台上。可使用胶带固定动物肢体,将其牢牢固定。
  3. 使用捏痛反应方法确定麻醉深度。动物必须处于无反应状态,然后才可继续下一步骤。
  4. 用手术刀在腹部沿隔膜切开。用锋利的剪刀切开隔膜底部的结缔组织,暴露胸壁。
  5. 将大剪刀钝口朝下,沿着胸壁中线偏左剪开肋骨。
  6. 在胸壁中心或两端水平剪开,打开胸腔。用夹钳打开胸腔并暴露心脏,排出血液和体液。
  7.  用镊子夹住心脏(心脏仍应跳动),将针头直接插入左心室的突起处,并向上延伸约 5 mm。注意,不要将针头插入太深,避免刺穿内壁、破坏溶液循环。将针头固定在插入点附近。打开阀门,使 0.9% 生理盐水溶液以 20 mL/min 左右的速度缓慢、稳定地滴入。
  8. 用锋利的剪刀剪开心房,确保溶液能够自由流动。如果液体未自由流动,或者液体从动物的鼻腔或口腔流出,请重置针头。
  9. 血液从身体排空后,将溶液更换为 4% 多聚甲醛溶液 (200–300 mL)。
  10. 在更换溶液时,小心不要引入气泡。在整个灌注过程中,最好戴上护目镜。
  11.  当观察到动物出现自发运动并且肝脏颜色变浅时,灌注基本完成。(通常成年大鼠需要约 30-60 分钟的灌注时间,但具体时间因动物体重和实验技术不同而异。)
  12. 停止灌注,切下目标组织。将组织放入盛有相同固定溶液的样本瓶中,在冰上或在 4 ℃ 下继续后固定 2 小时,然后进行脱水和包埋。为获得更好的结果,可在 4 ℃ 下浸泡过夜。

通过腹主动脉灌注固定

  1. 按上文所述准备试剂、器具和动物(步骤 1-3)。
  2. 沿腹部中线切一个长切口,并向两侧延伸,打开腹腔,将肠轻轻移到动物左侧。
  3. 小心暴露肾动脉起点下的主动脉,并剥离上方覆盖的脂肪和结缔组织。
  4.  用带齿纹的精密镊子在离主动脉末端分叉约 0.5-1.0 cm 处紧紧夹住主动脉壁。将弯针头在镊子附近向心脏方向插入主动脉腔中。
  5. 迅速完成以下连续步骤:     
  6. 1) 用小剪刀在下腔静脉上剪口
    2) 开始灌注
    3) 在肾动脉起点上方夹住隔膜下的主动脉

    ​在进行上述操作时,准确度和速度非常重要,并且固定过程最好由两个实验人员协同完成。灌注开始后,快速夹住动脉非常重要。最方便的做法是用手指(戴手套)将主动脉压到腹腔后壁,然后用夹钳取代手指施加压力。最后,剪断按压处上方的主动脉。
  7. 肾表面必须立即变白并显示均匀、苍白的颜色。对于成年大鼠,流速应至少为 60-100 mL/min。灌注 3 分钟。停止灌注,切下并修剪组织。将组织存放在样本瓶中,并浸入相同的固定剂中(后固定步骤),在冰上或 4 ℃ 固定 2 小时。为获得更好的结果,可在 4 ℃ 下浸泡固定过夜。​​   
  8. 然后,组织可进行脱水和包埋处理。


灌注固定疑难解答


溶液从动物的窍孔中流出 - 针头未正确插入。

尝试将针头向上插入左心房,使溶液不会流入肺中。注意,不要将针头插入过深,以免穿透内壁。可能需要多练习才能插入正确的位置,因此您可以尝试轻微移动针头,直到溶液不再从动物的鼻腔或口腔流出。

固定时间太长 - 固定溶液未正确循环。

确保您已将针正确夹在插入点,针孔处没有泄漏,针也没有刺穿心脏。要确认这一点很容易,您可以擦干心脏周围区域,观察固定剂是否泄漏。您也可以尝试重置针头。

刺穿心脏 - 灌注固定可能不彻底,并且样品器官/组织可能未正确固定。

尝试用夹钳将穿刺伤口封闭。继续灌注,并且在切下器官后,确保将器官置于相同的固定液中 2 小时以上。这种情况下,最好在 4 ℃ 浸泡过夜。

如果样品器官是睾丸,在切下后,尝试向尖区(白膜层正下方)内注射一些固定剂,以便固定内部的输精管。如果注射正确,睾丸将轻微膨胀并变硬。

如果您能够定位样品器官中的静脉,则可尝试向静脉中手动注射(使用注射器)固定剂。



冷冻切片固定

1.       将切片置于包被了 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES) 的载片上并封片,然后在气流下风干 30-60 分钟,以尽可能完全干燥切片。

2.       将切片保存在 -80 ℃ 下待用。如需获得最佳结果,请立即使用。

3.       如有必要,将切片在室温下静置复温 5 分钟。

4.       在室温下制备固定剂(丙酮、甲醇或乙醇)。对于新抗体,我们建议使用 3 种载片进行预实验:

1) 多聚甲醛
2) 丙酮
3) 1:1 的丙酮:醇(甲醇或乙醇)溶液

5.       用固定剂在室温下固定 15 分钟。

6.       用 PBS 冲洗 3-4 次。

7.       如果用丙酮固定,则需在气流下风干 30 分钟,以达到完全干燥。

8.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。


如果用于免疫荧光实验的组织样本需要使用醛固定剂(多聚甲醛、戊二醛等)固定,则需在封闭液中加入 0.3 M 甘氨酸,然后加入一抗。

甘氨酸能够结合游离醛基,避免醛基结合一抗和二抗,使背景偏高。当选用戊二醛或多聚甲醛作为固定剂时,易出现游离醛基导致的高背景。


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