IHC固定实验方案
IHC固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。此实验方案将指导您完成固定过程。
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固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。固定方法的选择取决于表位和抗体本身的灵敏度，并且可能需要一些优化。
我们可使用交联剂（例如多聚甲醛）进行固定。交联剂更有利于保持细胞结构，但可能降低某些细胞组分的抗原性，因为交联会阻断抗体的结合能力。此时可能需要进行抗原修复，特别是固定时间较长或使用较高浓度的交联固定剂时。
福尔马林
- 向玻片中加入 10% 中性福尔马林缓冲液 (NPF)，静置 10 分钟，
- 然后用 PBS 洗涤 3 次。
如果在福尔马林中固定 10-15 分钟以上，则蛋白质的交联程度将升高并需要进行抗原修复，以确保抗体能自由接近蛋白质，达到结合和检测目的。
乙醇
- 向每个玻片中加入 100–200 μL 95% 乙醇、5% 冰醋酸。
- 在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟，最好置于 Coplins 瓶中，
- 然后用 PBS 洗涤 3 次。
甲醇
- 向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的甲醇、5% 醋酸。
- 在 -20 ℃ 放置 10 分钟，最好置于 Coplins 瓶中，
- 然后用 PBS 洗涤 3 次。
乙醇和甲醇会使细胞通透化。某些抗原表位对甲醇极为敏感，因为甲醇可能会破坏表位结构。如果出现这种情况，在需要通透化时，可尝试使用丙酮代替甲醇。
丙酮
- 向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的丙酮。
- 在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟，
- 然后用 PBS 洗涤 3 次。
丙酮也会使细胞通透化，因此不需要额外的通透化步骤。
浸泡固定
最常使用 10% 中性福尔马林缓冲液 (NBF)。如果数据表中说明了 IHC-P 是经测试的应用，那么除非另有说明，否则均使用此固定剂。其它固定剂的使用频率较少，例如 Bouin 溶液（多聚甲醛/苦味酸）。
理想的固定时间取决于组织块大小和组织类型，但 18-24 小时的固定时间适用于大部分应用。固定不足可能导致边缘染色，即切片边缘具有强信号而中间没有信号。固定过度可能会掩盖表位；抗原恢复可帮助克服此问题，但如果组织的固定时间过长（即超过两天），那么即使进行抗原恢复也可能没有信号。
灌注固定
对于小组织来说,浸入固定溶液通常能获得足够的固定。但是，如果将固定溶液经由内循环系统（无论是通过心脏或通过腹主动脉）灌注，则往往能获得更快速、更均匀的固定。下文介绍了使用 4% 多聚甲醛固定大鼠的大部分器官的实验步骤。
灌注固定中使用的试剂和器具
- 麻醉剂
- 手术用剪刀、镊子和夹钳
- 带精细齿纹的小镊子
- 手术刀
- 带盖的样本瓶 (5–10 mL)
- 0.9% 生理盐水
- 500 mL 烧杯
- 4% 多聚甲醛，固定溶液
- 手套、护目镜
- 灌注泵（或置于手术台上方约 150 cm 的倒置烧瓶，内装有固定剂）
- 用于心脏主动脉灌流的带针头短注射器，长度约 50 mm，外径 1.3-1.5 mm
- 带滴注器的灌注套件，类似于静脉输血用品
通过心脏灌注固定
- 安装灌注泵；连接灌注套件和灌注针。首先，用约 100 mL 自来水冲洗管道，去除管道中的任何残留物。然后，将灌注管的开口末端放入盛有冷的 4% 多聚甲醛的烧杯（置于冰盒中）中。溶液体积应与动物体重成比例，通常一只动物使用 200-300 mL 固定液已足够。打开阀门，将滴速调整到缓慢、稳定的速度 (20 mL/min)，然后关闭阀门。
- 做好手术准备，放置好剪刀、镊子和夹钳。向动物注射适当剂量的麻醉剂。动物麻醉后，将其面朝上放在手术台上。可使用胶带固定动物肢体，将其牢牢固定。
- 使用捏痛反应方法确定麻醉深度。动物必须处于无反应状态，然后才可继续下一步骤。
- 用手术刀在腹部沿隔膜切开。用锋利的剪刀切开隔膜底部的结缔组织，暴露胸壁。
- 将大剪刀钝口朝下，沿着胸壁中线偏左剪开肋骨。
- 在胸壁中心或两端水平剪开，打开胸腔。用夹钳打开胸腔并暴露心脏，排出血液和体液。
- 用镊子夹住心脏（心脏仍应跳动），将针头直接插入左心室的突起处，并向上延伸约 5 mm。注意，不要将针头插入太深，避免刺穿内壁、破坏溶液循环。将针头固定在插入点附近。打开阀门，使 0.9% 生理盐水溶液以 20 mL/min 左右的速度缓慢、稳定地滴入。
- 用锋利的剪刀剪开心房，确保溶液能够自由流动。如果液体未自由流动，或者液体从动物的鼻腔或口腔流出，请重置针头。
- 血液从身体排空后，将溶液更换为 4% 多聚甲醛溶液 (200–300 mL)。
- 在更换溶液时，小心不要引入气泡。在整个灌注过程中，最好戴上护目镜。
- 当观察到动物出现自发运动并且肝脏颜色变浅时，灌注基本完成。（通常成年大鼠需要约 30-60 分钟的灌注时间，但具体时间因动物体重和实验技术不同而异。）
- 停止灌注，切下目标组织。将组织放入盛有相同固定溶液的样本瓶中，在冰上或在 4 ℃ 下继续后固定 2 小时，然后进行脱水和包埋。为获得更好的结果，可在 4 ℃ 下浸泡过夜。
通过腹主动脉灌注固定
- 按上文所述准备试剂、器具和动物（步骤 1-3）。
- 沿腹部中线切一个长切口，并向两侧延伸，打开腹腔，将肠轻轻移到动物左侧。
- 小心暴露肾动脉起点下的主动脉，并剥离上方覆盖的脂肪和结缔组织。
- 用带齿纹的精密镊子在离主动脉末端分叉约 0.5-1.0 cm 处紧紧夹住主动脉壁。将弯针头在镊子附近向心脏方向插入主动脉腔中。
- 迅速完成以下连续步骤：
- 1) 用小剪刀在下腔静脉上剪口
2) 开始灌注
3) 在肾动脉起点上方夹住隔膜下的主动脉
在进行上述操作时，准确度和速度非常重要，并且固定过程最好由两个实验人员协同完成。灌注开始后，快速夹住动脉非常重要。最方便的做法是用手指（戴手套）将主动脉压到腹腔后壁上，然后用夹钳取代手指施加压力。最后，剪断按压处上方的主动脉。 - 肾表面必须立即变白并显示均匀、苍白的颜色。对于成年大鼠，流速应至少为 60-100 mL/min。灌注 3 分钟。停止灌注，切下并修剪组织。将组织存放在样本瓶中，并浸入相同的固定剂中（后固定步骤），在冰上或 4 ℃ 固定 2 小时。为获得更好的结果，可在 4 ℃ 下浸泡固定过夜。
- 然后，组织可进行脱水和包埋处理。
灌注固定疑难解答
溶液从动物的窍孔中流出 - 针头未正确插入。
尝试将针头向上插入左心房，使溶液不会流入肺中。注意，不要将针头插入过深，以免穿透内壁。可能需要多练习才能插入正确的位置，因此您可以尝试轻微移动针头，直到溶液不再从动物的鼻腔或口腔流出。
固定时间太长 - 固定溶液未正确循环。
确保您已将针正确夹在插入点，针孔处没有泄漏，针也没有刺穿心脏。要确认这一点很容易，您可以擦干心脏周围区域，观察固定剂是否泄漏。您也可以尝试重置针头。
刺穿心脏 - 灌注固定可能不彻底，并且样品器官/组织可能未正确固定。
尝试用夹钳将穿刺伤口封闭。继续灌注，并且在切下器官后，确保将器官置于相同的固定液中 2 小时以上。这种情况下，最好在 4 ℃ 浸泡过夜。
如果样品器官是睾丸，在切下后，尝试向尖区（白膜层正下方）内注射一些固定剂，以便固定内部的输精管。如果注射正确，睾丸将轻微膨胀并变硬。
如果您能够定位样品器官中的静脉，则可尝试向静脉中手动注射（使用注射器）固定剂。
1. 将切片置于包被了 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES) 的载片上并封片，然后在气流下风干 30-60 分钟，以尽可能完全干燥切片。
2. 将切片保存在 -80 ℃ 下待用。如需获得最佳结果，请立即使用。
3. 如有必要，将切片在室温下静置复温 5 分钟。
4. 在室温下制备固定剂（丙酮、甲醇或乙醇）。对于新抗体，我们建议使用 3 种载片进行预实验：
1) 多聚甲醛
2) 丙酮
3) 1:1 的丙酮：醇（甲醇或乙醇）溶液
5. 用固定剂在室温下固定 15 分钟。
6. 用 PBS 冲洗 3-4 次。
7. 如果用丙酮固定，则需在气流下风干 30 分钟，以达到完全干燥。
8. 按免疫组化染色实验方案继续后续处理。
如果用于免疫荧光实验的组织样本需要使用醛固定剂（多聚甲醛、戊二醛等）固定，则需在封闭液中加入 0.3 M 甘氨酸，然后加入一抗。
甘氨酸能够结合游离醛基，避免醛基结合一抗和二抗，使背景偏高。当选用戊二醛或多聚甲醛作为固定剂时，易出现游离醛基导致的高背景。