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组蛋白WB实验方案

​​​剑桥大学 Tony Kouzarides 教授友情提供。

Abcam 常用的组蛋白WB实验方案,检测源自纯化小牛胸腺的组蛋白。

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  1. 每个泳道准备 0.5 μg 小牛胸腺或酸提取的组蛋白,稀释于加入了 100 mM DTT 的 1X LDS 样品缓冲液中。95 °C 煮样5 分钟,离心。


    请注意,细胞裂解物的上样量需要凭经验确定。


  2. 制备 10% Bis-Tris 凝胶,厚度为 1.0 mm。为了更好的分离分析组蛋白,建议使用较高百分比的凝胶 (15%)。

  3. 组蛋白样品上样,包括预染的蛋白标准品。于 200V 下在 MES SDS 电泳缓冲液中跑胶 35 分钟。



    在蛋白分子量较小时,染料前沿最好不要完全跑出凝胶。


  4. 对于转膜,请参考转膜仪器提供的实验方案,不同的转膜方法(即半干或湿法)会有所不同。转膜时间介于 30 分钟到 90 分钟之间;我们使用 1X 转膜缓冲液/20% 甲醇在 30V 下转 70 分钟。


    建议使用孔径为 0.2 mm NC膜使组蛋白保留在膜上。


  5. 使用丽春红染色验证组蛋白的成功转膜和相等的上样量。使用 dH2O 洗去染色。
  6. 在室温 (RT) 下使用 5% BSA/0.1% TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) 封闭 1 小时。
  7. 如有需要,将膜切成条带,并按照 Abcam 数据表中的推荐稀释度在封闭缓冲液 (5% BSA/0.1% TBST) 中稀释一抗。对于封闭肽,按照要求加入 (1 μg/mL),置于摇床上,室温孵育 20 分钟。一抗室温孵育 1.5 小时或 4 °C 过夜。
  8. 使用 0.1% TBST 中简单洗膜,随后使用相同的缓冲液洗涤两次,每次 5 分钟,接着再洗涤两次,每次 10 分钟。
  9. 在室温下孵育二抗 1 小时 [例如 ab6721:山羊多克隆抗兔 IgG H&L (HRP)],按照建议在 1% BSA/0.1% TBST 中进行稀释。
  10. 0.1% TBST 洗膜两次,每次 5 分钟,再洗涤两次,每次 10 分钟。
  11. 检测方法示情况而定,ECL、ECF 或红外荧光检测。举个例子:在膜上加 ECL 试剂室温 3 分钟,在不同曝光时间下捕获WB图像:10 秒、30 秒、1 分钟、2 分钟、3 分钟、4 分钟和 5 分钟。

使用组蛋白抗体系列成功进行WB的重要技巧。​​


  • 使用高百分比的凝胶。

  • 使用孔径为 0.2 µm 的NC膜。

  • 封闭液使用高质量 BSA,不要使用 Marvel 等常规奶粉。

  • 务必使用内参对照抗体!​​


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