组蛋白WB实验方案
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剑桥大学 Tony Kouzarides 教授友情提供。
Abcam 常用的组蛋白WB实验方案，检测源自纯化小牛胸腺的组蛋白。
- 每个泳道准备 0.5 μg 小牛胸腺或酸提取的组蛋白，稀释于加入了 100 mM DTT 的 1X LDS 样品缓冲液中。95 °C 煮样5 分钟，离心。
请注意，细胞裂解物的上样量需要凭经验确定。 制备 10% Bis-Tris 凝胶，厚度为 1.0 mm。为了更好的分离分析组蛋白，建议使用较高百分比的凝胶 (15%)。
- 组蛋白样品上样，包括预染的蛋白标准品。于 200V 下在 MES SDS 电泳缓冲液中跑胶 35 分钟。
在蛋白分子量较小时，染料前沿最好不要完全跑出凝胶。 - 对于转膜，请参考转膜仪器提供的实验方案，不同的转膜方法（即半干或湿法）会有所不同。转膜时间介于 30 分钟到 90 分钟之间；我们使用 1X 转膜缓冲液/20% 甲醇在 30V 下转 70 分钟。
建议使用孔径为 0.2 mm 的NC膜使组蛋白保留在膜上。
- 使用丽春红染色验证组蛋白的成功转膜和相等的上样量。使用 dH2O 洗去染色。
- 在室温 (RT) 下使用 5% BSA/0.1% TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) 封闭 1 小时。
- 如有需要，将膜切成条带，并按照 Abcam 数据表中的推荐稀释度在封闭缓冲液 (5% BSA/0.1% TBST) 中稀释一抗。对于封闭肽，按照要求加入 (1 μg/mL)，置于摇床上，室温孵育 20 分钟。一抗室温孵育 1.5 小时或 4 °C 过夜。
- 使用 0.1% TBST 中简单洗膜，随后使用相同的缓冲液洗涤两次，每次 5 分钟，接着再洗涤两次，每次 10 分钟。
- 在室温下孵育二抗 1 小时 [例如 ab6721：山羊多克隆抗兔 IgG H&L (HRP)]，按照建议在 1% BSA/0.1% TBST 中进行稀释。
- 0.1% TBST 洗膜两次，每次 5 分钟，再洗涤两次，每次 10 分钟。
- 检测方法示情况而定，ECL、ECF 或红外荧光检测。举个例子：在膜上加 ECL 试剂室温 3 分钟，在不同曝光时间下捕获WB图像：10 秒、30 秒、1 分钟、2 分钟、3 分钟、4 分钟和 5 分钟。