蛋白质印迹（Western blot）实验方案

我们的 western blot 实验方案包含溶液、试剂、检测步骤和有用的链接，可指导您完成整个实验。

2020 年 12 月 14 日审核

Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 PVDF（聚偏二氟乙烯）制成的膜。将凝胶紧贴膜放置，蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理，再通过二抗和检测试剂让膜显色。

目录

• 溶液与试剂：裂解缓冲液
• 溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液
• 样本裂解
• 样本制备
• 上样和跑胶
• 蛋白转膜
• 抗体染色
• 相关链接
• 网络研讨会记录

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溶液与试剂：裂解缓冲液

这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。

NP-40 缓冲液

• 150 mM 氯化钠
• 1.0% NP-40（可用 0.1% Triton X-100 代替）
• 50 mM Tris-HCl，pH 8.0
• 蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀检测缓冲液）

• 150 mM 氯化钠
• 1% IGEPAL CA-630
• 0.5% 脱氧胆酸钠
• 0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
• 50 mM Tris-HCl，pH 8.0
• 蛋白酶抑制剂

Tris-HCl

• 20 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）
• 蛋白酶抑制剂

溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液

Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液

• 4% SDS
• 10% 2-巯基乙醇
• 20% 甘油
• 0.004% 溴酚蓝
• 0.125 M Tris-HCl

测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8

电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）

• 25mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）
• 190mM 甘氨酸
• 0.1% SDS

测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3

转膜缓冲液（湿转）

• 25mM Tris base （三羟甲基氨基甲烷游离碱）
• 190mM 甘氨酸
• 20% 甲醇
• 测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3

对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。

转膜缓冲液（半干转）

• 48mM Tris base
• 39mM 甘氨酸
• 20% 甲醇
• 0.04% SDS

封闭缓冲液

3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）

加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。

样本裂解

细胞培养裂解液的制备

1. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
2. 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 10⁷ 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm² 烧瓶加 1 mL；每 5x10⁶ 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm² 烧瓶加 0.5 mL）。
3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。
4. 4℃ 下持续振摇 30 分钟。
5. 放入微型离心机，在 4°C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。
6. 轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。

组织裂解液的制备

1. 3.1 用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。
2. 将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织，向管中迅速加入约 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X 裂解液冲洗刀片两次，每次 200 μL，然后在 4℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。
3. 在微型离心机中 4℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。

样本制备

1. 取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。
2. 确定蛋白质的上样量，并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。
3. 对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100°C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。

上样和跑胶

3.1  将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg，纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。

3.2  在 100 V 下跑胶 1-2 小时。

时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。

凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：

也可以使用梯度凝胶。

蛋白从凝胶转移到膜

膜可以是硝酸纤维素，也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。

转膜层的制备如下：

图 1.制备好的转膜层示例。

抗体染色

1. 用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜。
2. 用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4°C 下过夜孵育；其他条件可以优化。
3. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
4. 用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。
5. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
6. 产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。
7. 利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

相关链接

• 查看更多 western blot 实验方案
• 查看所有 Abcam 内参对照。
• 示例内参对照：ab8227 beta actin

所有泳道：beta Actin 抗体 - 内参对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000

泳道 1：HeLa 全细胞提取物

泳道 2：酵母细胞提取物

泳道 3：小鼠脑组织裂解液

• 查看我们可提供的阳性对照裂解液、封闭肽和阳性对照蛋白清单。
• 查看蛋白质印迹中表现出色的 AbExcel 二抗。
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实验方案由 Abcam 根据 Abcam 实验室使用 Abcam 试剂和产品开展的实验“按原样”提供；在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。

网络研讨会记录

Western blot 的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上，从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂（如 β-巯基乙醇）的样本缓冲液中，95 ℃ 下加热样本 5 到 10 分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。

将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液，确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道，然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后，添加电泳缓冲液，给电泳槽盖上盖子。打开电源，按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶，直到染料前沿充分移动至凝胶。

下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 PVDF 制成。从凝胶槽中取出凝胶，并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚，并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间，制备转膜层。膜应靠近正极，凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱，并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水，以保持系统冷却，并盖上盖子。打开电源，开始转移蛋白。时间和电压需要优化，请查看制造商的说明。

现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了，可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出，现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要，可以用丽春红 S 溶液对膜进行染色，从而确认蛋白质的转移。为了防止抗体发生非特异性结合，需要封闭膜。将封闭缓冲液倒在膜上，并置于摇床上轻轻摇动。通常情况下，需要使用 5% 牛奶或牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 下孵育过夜。应优化封闭缓冲液的时间和类型，请查看您打算使用的一抗的数据表，了解详细信息。

膜封闭后，去除封闭缓冲液，在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样，置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1 小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导，请查阅抗体数据表。倒出一抗，用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1 次，时长 15 分钟，再洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。洗涤缓冲液通常是含 0.1% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。

倒掉洗涤缓冲液，在偶联二抗中孵育膜，二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时，但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗，并按照上述步骤清洗膜。

有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联，则成像前，应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗，可以直接进入成像步骤。成像时使用 X 射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带，可能需要优化曝光时间。