明胶酶谱法实验方案
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使用明胶酶谱法在条件培养基中检测 MMP 活性的实验方案
在本操作中，活性明胶酶消化包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的明胶。考马斯染色后，降解区域显示为深染色背景上的亮条带。
本实验方案针对在条件培养基中检测所分泌的 MMP-9 和 MMP-2 活性进行了优化。
条件培养基的制备
- 将胎牛血清 (FBS) 培养的细胞在六孔板（2 mL/孔）或 75 cm2 培养瓶 (10 mL) 中铺板。
- 达到 70%–80% 的汇合度时，去除 FBS 培养基。用不含 FBS 的培养基洗涤细胞两次，让细胞在不含 FBS 的培养基中继续生长。
在不含 FBS 的培养基中生长的时间长度必须根据细胞系进行优化。例如，在收集条件培养基之前，231G 和 468 乳腺癌细胞需要 40–44 h 的生长期。 - 收集条件培养基，然后离心或过滤，去除死细胞。
- 10X 浓缩条件培养基。
明胶酶谱法
跑胶
- 稀释条件培养基，让所有样品具有相同的蛋白质浓度。
对于每个样品，取一份在低蛋白质浓度 (5 µg/mL) 下进行测试，再取一份高蛋白质浓度 (15 µg/mL) 下测试。 - 向样品中加入 5X 非还原样品缓冲液。
- 制备含有明胶的 7.5% 丙烯酰胺凝胶。使用 1 mm 厚的板。详情参见下表。
- 向每个孔上样；通常每孔 10 μL 蛋白质较为合适。在一个孔中加入蛋白质分子量标记物。
- 在 150 V 下跑胶，直到得到良好的分离条带。
分离胶（7.5% 丙烯酰胺） | 浓缩胶 | ||
1.5 M Tris pH 8.8 | 2 mL | 0.5 M Tris pH 6.8 | 1.25 mL |
30% 丙烯酰胺 | 2 mL | 30% 丙烯酰胺 | 0.67 mL |
H2O | 2 mL | H2O | 3.08 mL |
4 mg/mL 明胶 | 2 mL | 10% SDS | 50 μL |
10% SDS | 80 μL | 10% APS | 50 μL |
10% APS | 80 μL | TEMED | 10 μL |
TEMED | 10 μL | | |
凝胶的洗涤与染色
- 在室温下一边搅拌一边用洗涤缓冲液洗涤凝胶 2 x 30 分钟。
将凝胶浸泡在洗涤缓冲液中可以清除凝胶上的 SDS。 - 在 37℃ 下一边搅拌一边用孵育缓冲液冲洗 5–10 分钟。
- 更换新鲜的孵育缓冲液，并在 37℃ 下孵育 24 h。
孵育缓冲液含有明胶酶发生反应所必需的辅因子。 - 在室温下一边搅拌一边用染色液对凝胶染色 30 分钟至 1 h。用 H2O 冲洗，直至清除了多余染色液。
- 与脱色液共孵育，直至可以清楚看到条带。
酶活性区域表现为深蓝色背景上的白色条带。
缓冲液
5X 非还原样品缓冲液 (pH 6.8)
最终浓度 | 每 250 mL |
4% SDS | 10 g |
20% 甘油 | 50 mL of 100% |
0.01% 溴酚蓝 | 0.025 g |
125 mM Tris-HCl | 4.91 g |
| H2O | 200 mL |
最终浓度 | 每 250 mL |
2.5% Triton X-100 | 6.25 mL of 100% |
50 mM Tris HCl | 12.5 mL of 1 M stock |
5 mM CaCl2 | 625 μL of 2 M stock |
1 μM ZnCl2 | 2.5 μL of 0.1 M stock |
H2O | 228 mL + 2 mL 2% NaN3 |
最终浓度 | 每 250 mL |
1% Triton X-100 | 2.5 mL of 100% |
50 mM Tris-HCl | 12.5 mL of 1 M |
5 mM CaCl2 | 625 μl of 2 M |
1 µM ZnCl2 | 2.5 μl of 0.1 M |
H2O | 233 mL + 2 mL 2% NaN3 |
每 100 mL | |
甲醇 | 40 mL |
醋酸 | 10 mL |
H2O | 50 mL |
考马斯亮蓝 | 0.5 g |
每 1 L | |
甲醇 | 400 mL |
醋酸 | 100 mL |
H2O | 500 mL |