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明胶酶谱法实验方案

使用明胶酶谱法在条件培养基中检测 MMP 活性的实验方案

在本操作中,活性明胶酶消化包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的明胶。考马斯染色后,降解区域显示为深染色背景上的亮条带。
本实验方案针对在条件培养基中检测所分泌的 MMP-9 和 MMP-2 活性进行了优化。
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在本操作中,活性明胶酶消化包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的明胶。考马斯染色后,降解区域显示为深染色背景上的亮条带。

本实验方案针对在条件培养基中检测所分泌的 MMP-9 和 MMP-2 活性进行了优化。

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条件培养基的制备


  1. 将胎牛血清 (FBS) 培养的细胞在六孔板(2 mL/孔)或 75 cm2 培养瓶 (10 mL) 中铺板。
  2. 达到 70%–80% 的汇合度时,去除 FBS 培养基。用不含 FBS 的培养基洗涤细胞两次,让细胞在不含 FBS 的培养基中继续生长。

    在不含 FBS 的培养基中生长的时间长度必须根据细胞系进行优化。例如,在收集条件培养基之前,231G 和 468 乳腺癌细胞需要 40–44 h 的生长期。
  3. 收集条件培养基,然后离心或过滤,去除死细胞。
  4. 10X 浓缩条件培养基。

​明胶酶谱法


​​跑胶

  1. 稀释条件培养基,让所有样品具有相同的蛋白质浓度。

    对于每个样品,取一份在低蛋白质浓度 (5 µg/mL) 下进行测试,再取一份高蛋白质浓度 (15 µg/mL) 下测试
  2. 向样品中加入 5X 非还原样品缓冲液。
  3. 制备含有明胶的 7.5% 丙烯酰胺凝胶。使用 1 mm 厚的板。详情参见下表。
  4. 向每个孔上样;通常每孔 10 μL 蛋白质较为合适。在一个孔中加入蛋白质分子量标记物。
  5. 150 V 下跑胶,直到得到良好的分离条带。

分离胶(7.5% 丙烯酰胺)

浓缩胶

1.5 M Tris pH 8.8

2 mL

0.5 M Tris pH 6.8

1.25 mL

30% 丙烯酰胺

2 mL

30% 丙烯酰胺

0.67 mL

H2O

2 mL

H2O

3.08 mL

4 mg/mL 明胶

2 mL

10% SDS

50 μL

10% SDS

80 μL

10% APS

50 μL

10% APS

80 μL

TEMED

10 μL

TEMED

10 μL



凝胶的洗涤与染色

  1. 在室温下一边搅拌一边用洗涤缓冲液洗涤凝胶 2 x 30 分钟。

    将凝胶浸泡在洗涤缓冲液中可以清除凝胶上的 SDS
  2. 37 下一边搅拌一边用孵育缓冲液冲洗 510 分钟。
  3. 更换新鲜的孵育缓冲液,并在 37 下孵育 24 h

    孵育缓冲液含有明胶酶发生反应所必需的辅因子
  4. 在室温下一边搅拌一边用染色液对凝胶染色 30 分钟至 1 h。用 H2O 冲洗,直至清除了多余染色液。
  5. 脱色液共孵育,直至可以清楚看到条带。

    酶活性区域表现为深蓝色背景上的白色条带

​​

缓冲液

5X 非还原样品缓冲液 (pH 6.8)

最终浓度

每 250 mL

4% SDS

10 g

20% 甘油

50 mL of 100%

0.01% 溴酚蓝

0.025 g

125 mM Tris-HCl

4.91 g

H2O

200 mL


洗涤缓冲液 (pH 7.5)

最终浓度

每 250 mL

2.5% Triton X-100              

6.25 mL of 100%

50 mM Tris HCl

12.5 mL of 1 M stock

5 mM CaCl2                       

625 μL of 2 M stock

1 μM ZnCl2                      

2.5 μL of 0.1 M stock

H2O

228 mL + 2 mL 2% NaN3


孵育缓冲液 (pH 7.5)

最终浓度

每 250 mL

1% Triton X-100            

2.5 mL of 100%

50 mM Tris-HCl

12.5 mL of 1 M

5 mM CaCl2   

625 μl of 2 M

1 µM ZnCl2            

2.5 μl of 0.1 M

H2O

233 mL + 2 mL 2% NaN3


染色液


每 100 mL

甲醇

40 mL

醋酸

10 mL

H2O

50 mL

考马斯亮蓝

0.5 g


脱色液


每 1 L

甲醇

400 mL

醋酸

100 mL

H2O

500 mL


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