为了使您在Abcam官网的浏览体验更顺畅,请使用最新版本的浏览器比如 Google Chrome

我们使用cookies,使我们网站尽可能对您有帮助。

我们的Cookie政策介绍了您如何能够取消cookie使用。

如果您不改变cookie设置,我们认为您愿意接受cookie。

继续 继续

致电 +86 21 2070 0500 或 联系我们

  • 我的账户
  • 退出
登录 或 注册

欢迎光临

登录 或

您还没有帐户?

注册
我的购物篮
快速订购
Abcam homepage

  • 研究用途的产品
    按产品类型
    一抗
    二抗
    免疫测定试剂盒与试剂
    细胞与组织成像工具
    细胞与生化测定
    蛋白质与肽
    按产品类型
    蛋白质组学工具
    激动剂、活化剂、拮抗剂与抑制剂
    细胞株和裂解液
    多重miRNA检测
    多因子分析试剂盒
    按研究领域
    癌症
    心血管
    细胞生物学
    表观遗传学
    代谢
    发育生物学
    按研究领域
    免疫学
    微生物学
    神经科学
    信号转导
    干细胞
  • 诊断和治疗的解决方案
    定制方案及合作关系

    定制抗体开发及商务合作助力您的诊断和治疗探索。

    与我们一起开创定制方案

    与我们成为伙伴

  • 技术支持
    支持中心

    获取研究建议和支持

    查看支持中心

    Protocols

    一步一步完成您的实验

    查看Protocols

  • 活动通知
    • 会议年历
    • 肿瘤研究
    • 心血管研究
    • 染色质及细胞核信号转导研究
    • 免疫学
    • 神经生物学
    • 干细胞研究
    • 商品展览
    • 实验技术视频
    查看最新活动

    活动说明、摘要提交、演讲者、注册方式及更多信息

    查看全球活动安排

  • 通路
    细胞信号转导通路

    查看所有通路

    查看交叉通路

在新冠疫情期间支持我们的客户和员工–了解更多

流式细胞术荧光补偿

Related

  • 流式细胞术实验方案
    • 流式细胞术概述
      • 推荐对照
        • 直接流式细胞术
          • 间接流式细胞术
            • 细胞内染色
              • 细胞周期分析
                • 免疫分型
                  • 荧光补偿
                    • 活细胞 FACS
                        • 流式细胞术资源
                          • 荧光染料表 – 完整指南
                            • 流式细胞仪多色选择器
                              • 科研产品

                                ​​流式细胞术的荧光补偿。

                                打印本实验方案。

                                本文介绍了流式细胞术需要补偿的原因,以及如何应用补偿。请参见制造商说明和软件手册,获取有关您仪器的详细补偿步骤。

                                什么是补偿?

                                所有的荧光染料都同时具有激发和发射光谱。激发光谱是增加荧光染料能量的光波长范围,可使荧光染料发射另一波长范围的光,即发射光谱。

                                在流式细胞仪中,带通滤光片用于选择适宜范围的激发和发射波长。但是,当发射光谱重叠时,会检测到来自一种以上荧光染料发射的荧光。因此,为修正这类光谱重叠,需要进行荧光补偿。这一过程可确保特定检测器检测的荧光仅来自目标荧光染料。 ​

                                下面的示例中,受 488 nm 的光激发后,PE 发射的光大部分被专门检测 PE 的检测器检测到,但是发射光谱尾部落在了用于检测 PE-Cy5 的带通滤光片中。这样,PE-Cy5 通道中就会观察到“假阳性”信号,因此需要进行荧光补偿以修正这类重叠。

                                激发和发射光谱谱图

                                ​

                                示例总结

                                1. 运行仅用 PE-标记抗体染色的样品。观察 PE 和 PE-Cy5 通道中的信号。
                                2. 调节补偿设置直到 PE-Cy5 通道中不再观察到 PE 信号(参见下面的步骤)。

                                (PE-Cy5 + PE 重叠) - (PE 重叠) = 准确的 PE-Cy5 结果

                                一般步骤

                                为任何细胞仪设置正确荧光补偿的步骤本质上是一样的,但不同的仪器之间会有轻微差异,因此很难提供“万全”的实验方案。尽管如此,以下指导方法在多数情况下仍适用。我们通常建议查看流式细胞仪制造商说明,以获取详细的荧光补偿指南。

                                1. 使用标准微珠确保细胞仪的性能符合规格。 
                                2. 利用未染色的样品设置荧光通道电压。调节前向和侧向散射光,以便清楚界定细胞群。在后续分析中,死细胞、细胞团以及细胞碎片应被排除。
                                3. 应尽可能避免使用发射光谱重叠程度较高的某些荧光染料组合(例如,APC 和 PE-Cy5)。各荧光染料都需要补偿对照,并且应包含阳性和阴性细胞群。设置补偿时应单独使用补偿对照。

                                  阳性细胞群的亮度应至少与实验中包含的其他细胞的亮度相当,并且应占所有细胞群的 10%。染色前,阳性细胞群的自发荧光应与阴性对照一样。理想情况下,对照样品中的阳性和阴性细胞群应为同类型细胞。如果无法实现,请考虑使用荧光补偿微珠。

                                  或者,也可以使用不同类型的细胞作为补偿对照,前提是其能够表达目标标记物。如果对照细胞中的目标标记物含量极低或不存在,则可使用靶向更常见标记物的其他抗体,但需携带相同的荧光染料。由于化学偶联的差异,串联染料(例如,PE-Cy5)可能会导致更多问题。建议使用同一批次的串联染料。
                                4. 通常,补偿设置从处于光谱的远红端(更高的波长)的荧光染料开始,逐步往下到那些处于光谱的低端的荧光染料。务必检查所有通道的补偿情况。

                                  虽然大部分重叠会出现在峰值发射的高波长一侧,但根据光谱发射曲线的形状,部分溢出/重叠可能出现在相反方向,即峰值发射的低波长一侧。使用的荧光染料数越多,这个问题就越严重。如果阴性细胞群中存在更宽范围的荧光强度,补偿会更困难,检测灵敏度也会降低。
                                5. 溢出通道中阴性细胞群的中值等于阳性细胞群的中值时,补偿设置正确。例如,如果将 FITC 染色的阳性样品用于补偿 PE 通道,阴性和 FITC 阳性细胞群的中值应与 PE 通道相同。出现 FITC 泄漏的所有通道都应进行补偿。
                                6. 补偿水平可在线(手动或通过软件“向导”)或离线设置。无论何种情况,都应保存单色对照设置,以用于采集后补偿或进行调节。

                                ​

                                实用链接

                                ​​

                                • Mario Roederer's 补偿指南



                                该文档是与英国癌症研究院 FACS 实验室(位于英国伦敦林肯因河广场 44 号)的 Derek Davies 共同制作完成。

                                通过邮件收到学术资源和促销信息 注册
                                研究类别(A-Z)
                                • 肿瘤研究
                                • 心血管研究
                                • 细胞生物学
                                • 发育生物学
                                • 染色质及细胞核信号转导研究
                                • 免疫学
                                • 代谢
                                • 微生物学
                                • 神经生物学
                                • 信号转导研究
                                • 干细胞研究
                                产品种类(A-Z)
                                • 一抗
                                • 二抗
                                • 生化试剂
                                • 亚类对照
                                • 流式细胞仪多色选择器
                                • 试剂盒
                                • 内参对照
                                • 细胞裂解液
                                • 多肽
                                • 蛋白酶
                                • 组织切片
                                • 蛋白标签及细胞标记物
                                • 相关试剂及工具
                                帮助与支持
                                • 技术支持
                                • 技术FAQ
                                • 实验步骤与建议
                                • 购买FAQ
                                • RabMAb 产品
                                • 培训课程
                                • 按靶标浏览
                                企业
                                • 企业资讯
                                • 投资者关系
                                • 公司新闻
                                • 招贤纳士
                                • 关于我们
                                活动通知
                                • 商品展览
                                • 会议
                                全球网站
                                • abcam.com
                                • abcam.co.jp
                                QR code for Weechat

                                微信扫码 关注我们

                                沪ICP备14046373号-1

                                沪公网安备 31011502007413号

                                • 销售条款
                                • 网站使用条款
                                • Cookie政策
                                • 隐私权政策
                                • 法律
                                © 1998-2021 艾博抗(上海)贸易有限公司版权所有