流式细胞术荧光补偿
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流式细胞术的荧光补偿。
本文介绍了流式细胞术需要补偿的原因，以及如何应用补偿。请参见制造商说明和软件手册，获取有关您仪器的详细补偿步骤。
什么是补偿？
所有的荧光染料都同时具有激发和发射光谱。激发光谱是增加荧光染料能量的光波长范围，可使荧光染料发射另一波长范围的光，即发射光谱。
在流式细胞仪中，带通滤光片用于选择适宜范围的激发和发射波长。但是，当发射光谱重叠时，会检测到来自一种以上荧光染料发射的荧光。因此，为修正这类光谱重叠，需要进行荧光补偿。这一过程可确保特定检测器检测的荧光仅来自目标荧光染料。
下面的示例中，受 488 nm 的光激发后，PE 发射的光大部分被专门检测 PE 的检测器检测到，但是发射光谱尾部落在了用于检测 PE-Cy5 的带通滤光片中。这样，PE-Cy5 通道中就会观察到“假阳性”信号，因此需要进行荧光补偿以修正这类重叠。
激发和发射光谱谱图
示例总结
- 运行仅用 PE-标记抗体染色的样品。观察 PE 和 PE-Cy5 通道中的信号。
- 调节补偿设置直到 PE-Cy5 通道中不再观察到 PE 信号（参见下面的步骤）。
(PE-Cy5 + PE 重叠) - (PE 重叠) = 准确的 PE-Cy5 结果
一般步骤
为任何细胞仪设置正确荧光补偿的步骤本质上是一样的，但不同的仪器之间会有轻微差异，因此很难提供“万全”的实验方案。尽管如此，以下指导方法在多数情况下仍适用。我们通常建议查看流式细胞仪制造商说明，以获取详细的荧光补偿指南。
- 使用标准微珠确保细胞仪的性能符合规格。
- 利用未染色的样品设置荧光通道电压。调节前向和侧向散射光，以便清楚界定细胞群。在后续分析中，死细胞、细胞团以及细胞碎片应被排除。
- 应尽可能避免使用发射光谱重叠程度较高的某些荧光染料组合（例如，APC 和 PE-Cy5）。各荧光染料都需要补偿对照，并且应包含阳性和阴性细胞群。设置补偿时应单独使用补偿对照。
阳性细胞群的亮度应至少与实验中包含的其他细胞的亮度相当，并且应占所有细胞群的 10%。染色前，阳性细胞群的自发荧光应与阴性对照一样。理想情况下，对照样品中的阳性和阴性细胞群应为同类型细胞。如果无法实现，请考虑使用荧光补偿微珠。
或者，也可以使用不同类型的细胞作为补偿对照，前提是其能够表达目标标记物。如果对照细胞中的目标标记物含量极低或不存在，则可使用靶向更常见标记物的其他抗体，但需携带相同的荧光染料。由于化学偶联的差异，串联染料（例如，PE-Cy5）可能会导致更多问题。建议使用同一批次的串联染料。 - 通常，补偿设置从处于光谱的远红端（更高的波长）的荧光染料开始，逐步往下到那些处于光谱的低端的荧光染料。务必检查所有通道的补偿情况。
虽然大部分重叠会出现在峰值发射的高波长一侧，但根据光谱发射曲线的形状，部分溢出/重叠可能出现在相反方向，即峰值发射的低波长一侧。使用的荧光染料数越多，这个问题就越严重。如果阴性细胞群中存在更宽范围的荧光强度，补偿会更困难，检测灵敏度也会降低。 - 溢出通道中阴性细胞群的中值等于阳性细胞群的中值时，补偿设置正确。例如，如果将 FITC 染色的阳性样品用于补偿 PE 通道，阴性和 FITC 阳性细胞群的中值应与 PE 通道相同。出现 FITC 泄漏的所有通道都应进行补偿。
- 补偿水平可在线（手动或通过软件“向导”）或离线设置。无论何种情况，都应保存单色对照设置，以用于采集后补偿或进行调节。
实用链接
该文档是与英国癌症研究院 FACS 实验室（位于英国伦敦林肯因河广场 44 号）的 Derek Davies 共同制作完成。