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流式细胞术荧光补偿

​​流式细胞术的荧光补偿。

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本文介绍了流式细胞术需要补偿的原因,以及如何应用补偿。请参见制造商说明和软件手册,获取有关您仪器的详细补偿步骤。

什么是补偿?

所有的荧光染料都同时具有激发和发射光谱。激发光谱是增加荧光染料能量的光波长范围,可使荧光染料发射另一波长范围的光,即发射光谱。

在流式细胞仪中,带通滤光片用于选择适宜范围的激发和发射波长。但是,当发射光谱重叠时,会检测到来自一种以上荧光染料发射的荧光。因此,为修正这类光谱重叠,需要进行荧光补偿。这一过程可确保特定检测器检测的荧光仅来自目标荧光染料。 

下面的示例中,受 488 nm 的光激发后,PE 发射的光大部分被专门检测 PE 的检测器检测到,但是发射光谱尾部落在了用于检测 PE-Cy5 的带通滤光片中。这样,PE-Cy5 通道中就会观察到“假阳性”信号,因此需要进行荧光补偿以修正这类重叠。

激发和发射光谱谱图

示例总结

  1. 运行仅用 PE-标记抗体染色的样品。观察 PE 和 PE-Cy5 通道中的信号。
  2. 调节补偿设置直到 PE-Cy5 通道中不再观察到 PE 信号(参见下面的步骤)。

(PE-Cy5 + PE 重叠) - (PE 重叠) = 准确的 PE-Cy5 结果

一般步骤

为任何细胞仪设置正确荧光补偿的步骤本质上是一样的,但不同的仪器之间会有轻微差异,因此很难提供“万全”的实验方案。尽管如此,以下指导方法在多数情况下仍适用。我们通常建议查看流式细胞仪制造商说明,以获取详细的荧光补偿指南。

  1. 使用标准微珠确保细胞仪的性能符合规格。 
  2. 利用未染色的样品设置荧光通道电压。调节前向和侧向散射光,以便清楚界定细胞群。在后续分析中,死细胞、细胞团以及细胞碎片应被排除。
  3. 应尽可能避免使用发射光谱重叠程度较高的某些荧光染料组合(例如,APC 和 PE-Cy5)。各荧光染料都需要补偿对照,并且应包含阳性和阴性细胞群。设置补偿时应单独使用补偿对照。

    阳性细胞群的亮度应至少与实验中包含的其他细胞的亮度相当,并且应占所有细胞群的 10%。染色前,阳性细胞群的自发荧光应与阴性对照一样。理想情况下,对照样品中的阳性和阴性细胞群应为同类型细胞。如果无法实现,请考虑使用荧光补偿微珠。

    或者,也可以使用不同类型的细胞作为补偿对照,前提是其能够表达目标标记物。如果对照细胞中的目标标记物含量极低或不存在,则可使用靶向更常见标记物的其他抗体,但需携带相同的荧光染料。由于化学偶联的差异,串联染料(例如,PE-Cy5)可能会导致更多问题。建议使用同一批次的串联染料。
  4. 通常,补偿设置从处于光谱的远红端(更高的波长)的荧光染料开始,逐步往下到那些处于光谱的低端的荧光染料。务必检查所有通道的补偿情况。

    虽然大部分重叠会出现在峰值发射的高波长一侧,但根据光谱发射曲线的形状,部分溢出/重叠可能出现在相反方向,即峰值发射的低波长一侧。使用的荧光染料数越多,这个问题就越严重。如果阴性细胞群中存在更宽范围的荧光强度,补偿会更困难,检测灵敏度也会降低。
  5. 溢出通道中阴性细胞群的中值等于阳性细胞群的中值时,补偿设置正确。例如,如果将 FITC 染色的阳性样品用于补偿 PE 通道,阴性和 FITC 阳性细胞群的中值应与 PE 通道相同。出现 FITC 泄漏的所有通道都应进行补偿。
  6. 补偿水平可在线(手动或通过软件“向导”)或离线设置。无论何种情况,都应保存单色对照设置,以用于采集后补偿或进行调节。

实用链接

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该文档是与英国癌症研究院 FACS 实验室(位于英国伦敦林肯因河广场 44 号)的 Derek Davies 共同制作完成。

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