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流式细胞术胞内染色实验方案

采用流式细胞术检测胞内蛋白质的通用方法。

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固定与穿透

进行胞内染色之前应固定细胞,确保可溶性抗原以及半衰期较短的抗原的稳定性(请参阅下文的“特别建议”查看例外情况)。这样可让目标蛋白质在细胞中保持在原本的位置。

如需检测胞内抗原,应在染色之前进行细胞穿透处理。抗体应在具有穿透功能的缓冲液中制备,以确保细胞维持通透状态。在设门选定细胞群时,穿透处理后的细胞在流式细胞仪上的光散射特性将发生明显变化。NB 细胞表面染色应在固定之前进行。

可使用以下几种方法进行细胞固定和透化处理:

依次使用甲醛和洗涤剂

在 0.01% 甲醛中固定 10-15 min,然后用以下其中一种洗涤剂破坏细胞膜:

·         Triton 或 NP-40(溶于 PBS,0.1–1%)可部分溶解核膜,因此适于核抗原染色。细胞膜和细胞质的损失会导致光散射降低,非特异性荧光减少。

·         Tween 20、皂素、洋地黄皂苷和 Leucoperm(溶于 PBS,0.5% v/v),可在膜上开孔使抗体通过,而不会溶解细胞质膜。这些洗涤剂适合用于检测细胞质中的抗原,或细胞质膜上面向细胞质一面的抗原,以及可溶性核抗原。


依次使用甲醛 (0.01%) 和甲醇


依次使用甲醇和洗涤剂

·         向每个样品中加入 1 mL 冰浴预冷的甲醇

·         轻轻混合并在 -20 ℃ 下静置 10 min

·         离心,然后用含 1% BSA 的 PBS 洗涤两次

丙酮固定和穿透

·         向每个样品中加入 1 mL 冰浴预冷的丙酮

·         轻轻混合并在 -20 ℃ 下静置 5-10 min

·         离心,然后用含 1% BSA 的 PBS 洗涤两次

使用丙酮时切勿使用塑料样品管。



​特别建议

靠近质膜的抗原以及可溶性胞浆抗原适用温和的细胞穿透处理,无需固定。

对于细胞骨架、病毒和某些酶抗原,使用高浓度丙酮、乙醇或甲醛进行固定通常可获得最理想的结果。

胞浆内细胞器和颗粒中抗原的染色应根据其抗原的类型选择固定和穿透的方法,确保抗原表位可以被接触到。



​胞内染色步骤

1.       根据上述说明固定组织样本

2.       加入 100 µL 洗涤剂为基础的穿透剂,在室温下避光孵育 15 min

3.       用 2 mL PBS(含 0.1% triton 或其它穿透洗涤剂)洗涤细胞,以 300 g (2,000 rpm) 的速度离心 5 min,弃去上清液,重悬剩余物中的沉淀

4.       按照直接和间接实验方案中的抗体染色步骤进行操作

在穿透缓冲液中制备抗体,以确保细胞维持通透状态。



分泌型蛋白检测

分泌型蛋白可能会快速降解,因此对其进行检测可能非常困难。使用 Brefaldin A 或其它可阻止高尔基体释放蛋白质的化合物,有助于检测表达这类蛋白的细胞。



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