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使用碘化丙啶(PI)DNA染色法进行流式细胞术细胞周期分析

​​​​​采用碘化丙啶 DNA 染色法的流式细胞术细胞周期分析

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流式细胞分析简介

通过定量测定 DNA 含量来分析细胞周期是流式细胞术最早的应用之一。

哺乳动物、酵母、植物或细菌细胞的 DNA 均可采用多种 DNA 结合染料染色。当然,前提是这些染料可进行化学计量,即这些染料与细胞中的 DNA 以一定的比例结合。

如此一来,S 期细胞由于 DNA 含量高于 G1 期细胞,会按比例吸收更多的染料,发出更亮的荧光,直到细胞的 DNA 复制结束。因此,G2 期细胞的亮度约为 G1 期细胞亮度的 2 倍。

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DNA 结合染料包括碘化丙啶 (PI)、7-氨基放线菌素 D (7-AAD)、Hoechst 33342、33258 和 S769121、TO-PRO-3、4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)、DRAQ5™ 和 DRAQ7™。

在大部分情况下,我们必须对细胞进行固定或透化处理,染料才能进入细胞,否则染料会被活细胞主动泵出。固定时通常使用醇或醛。醇是脱水固定剂,兼具透化作用。此类固定剂可让染料更容易接触 DNA,得出高质量数据(变异系数 (CV) 低)。它们的缺点是通常与荧光蛋白和某些表面标记物不相容。

如果需要同时检测荧光蛋白或表面标记物,更适合使用醛(交联)固定剂,通常为多聚甲醛。虽然这可能会影响数据质量(CV 较高),但可同时检测其它荧光染料和膜结合蛋白。然而多聚甲醛通常无法使细胞膜透化,因此需要进一步处理样品。

细胞固定后,即可对样本进行沉积、染色并在实验最后进行分析。醇固定的细胞在 4 ℃ 下可保持稳定数周。醛固定的细胞则可保持稳定 2 至 3 天。

让 DNA 染料进入细胞的另一种方法是用洗涤剂透化细胞。可用的洗涤剂包括 Triton X-100 (0.1%) 或 NP40 (0.1%)。Saponin 的核膜透化效果不佳,因此不建议将其用作 DNA 分析的透化剂。透化的细胞不能像固定细胞一样长时间保存,应在数小时内进行处理。

胞内染色通常需要将固定(多聚甲醛)和透化 (Triton X-100) 处理相结合。您也可以使用其它方法进行胞内染色,比如配合使用柠檬酸缓冲液和洗涤剂,但这些方法并不常用。还有一些染料能进入活细胞并与 DNA 定量结合,例如 Hoechst 33342、DRAQ5™ (ab108410) 和 DyeCycle 染料。

所用的方法取决于具体实验和您要获取的数据。本实验方案使用 PI 来标记 DNA。

​​试剂

  •  70% 乙醇
  •  碘化丙啶(存储液,50 µg/mL)
  •  核糖核酸酶 I(存储液,100 mg/mL)

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方法

1.       用适当方法收集细胞并在 PBS 中洗涤。

2.       在预冷的 70% 乙醇中固定。在涡旋搅拌的同时向细胞沉淀中逐滴加入乙醇。这样可确保所有细胞都能固定,最大限度避免细胞聚集。

3.       在 4 ℃ 下固定 30 min。

4.       用 PBS 洗涤 2 次。以 850 g 的速度在离心机中离心,弃去上清液时(尤其是离心去除乙醇时)应小心操作避免损失细胞。

5.       用核糖核酸酶处理细胞。加入 50 µL RNase存储液 (100 µg/mL)。这可确保仅染色 DNA,而不会染色 RNA。

6.       加入 200 µL PI (50 µg/mL 的存储液)。

结果分析

1.       测量前向散射 (FS) 和侧向散射 (SS),以识别单个细胞。

2.       脉冲处理可排除分析中的粘合细胞。根据流式细胞仪类型不同,可分别根据脉冲面积与脉冲宽度的关系或者脉冲面积与脉冲高度的关系进行判断。  

3.       PI 的最大发射波长为 605 nm,因此可用合适的带通滤波器进行测量。

预期结果

运行流式细胞仪时,应绘制以下图形:
前向散射与侧向散射数据图,用于识别单个细胞;
脉冲形状分析图,用于识别细胞团及粘合细胞(根据流式细胞仪类型不同,该图可能为脉冲面积-脉冲宽度图,或者脉冲面积-脉冲高度图);
前向散射- PI 信号图;PI 直方图。



进行分析时,首先使用脉冲宽度-脉冲面积图设门,选定单个细胞群。然后将此门应用于散射图并排除明显的细胞碎片。结合两个设门门并应用于 PI 直方图。


可通过以下两种方法定量分析处于细胞周期各阶段的细胞所占的百分比:

1.       在分析程序内通过人为设定不同的标志来计算

2.       使用尝试将每个阶段的细胞拟合为高斯曲线的算法。某些流式细胞术软件提供这种方法,与依靠肉眼观察来设定标记物的方法相比,此法更加客观。

疑难解答和提示

1.       应尽可能维持细胞浓度,以便保证所用的样本压力差最低。这样可确保核心样本流尽可能狭窄,并得到最佳的 CV 值。CV(变异系数)是数据离散的度量值,其定义为标准差 (sd) 除以平均值 (m),并以百分比形式 (sd/m × 100) 表示。

2.       切勿使用 PBS 配制 70% 乙醇,因为这会导致蛋白质在固定过程中发生沉淀。应使用 70 份无水乙醇和 30 份蒸馏水配制。

3.       单参数 DNA 分析无法给出任何动力学信息,也无法区分 G1 期细胞与极早期的 S 期细胞,以及 G2 期细胞与 S 期晚期细胞,此外,G2 期细胞与分裂期细胞同样无法区分。要解决这一问题,需采用溴脱氧尿苷 (BrdU) 技术,也可结合细胞周期阶段特异性标记物(例如,有丝分裂期的特异性标记物磷酸化 H3)进行 DNA 分析。

相关出版物及链接

Consensus on DNA analysis by flow cytometry (Book).M.G. Ormerod, B. Tribukait, Walter Giaretti.



Protocol edited from procedure kindly provided by:
Derek Davies, FACS Laboratory, London Research Institute, Cancer Research UK
44 Lincolns Inn Fields, London, UK.

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