ELISA样品制备指南

​​ELISA实验前进行样品制备的提示。

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有关样品制备和兼容样品类型的特定产品详情,请参阅您试剂盒中所附的方案。

本指南旨在作为教育资源使用。这些是制备用于 ELISA 试验的常用待测样品的一般指导原则。与试验开发的所有方面一样,最佳样品制备程序因实验目标的不同而有所不同。开发新的实验时,最好查阅文献,以获得与您自己的样品类似的实验示例

样品制备方法

细胞培养上清液

  • 移取细胞培养基至离心管中,4℃ 下以 1500 rpm 的速度离心 10 分钟。
  • 立即分装上清液,并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

细胞提取物

  • 将组织培养板置于冰上。
  • 吸取培养基,并小心地用冰冷的 PBS 清洗细胞一次。

  • 吸取 PBS,每 100 mm 孔板加入 0.5 mL 完全提取缓冲液。

  • 刮取细胞收集在倾斜的孔板中,并移至预冷的试管内。

  • 短暂涡旋,冰上孵育 15-30 分钟。

  • 4℃ 下以 13,000 rpm 的速度离心 10 分钟,沉淀不溶性内容物。

  • 将上清液(即可溶性细胞提取物)等分,置于冰上清洁冷冻管,并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

条件培养液

  • 将细胞置于完全(含血清)生长培养基中,使细胞增殖至所需的融合水平。
  • 去除生长培养基,并非常小心地用几毫升温 PBS 清洗。重复清洗步骤。

  • 去除最后一次 PBS 洗液,小心地加入无血清生长培养基。

  • 孵育 1-2 天。

  • 移取培养基至离心管中,4℃ 下以 1500 rpm 的速度离心 10 分钟。

  • 立即分装上清液,并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

牛奶

  • 采集样品,4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
  • 分装上清液并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

​​血浆

  • 将全血收集到含抗凝剂的试管中,例如 BD Vacutainer 电凝管(目录号:363080/363080)或加入 0.1 M 柠檬酸钠至 1/10 最终体积。​​
  • 4℃ 下以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟。

  • 立即分装上清液(血浆),并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

​​尿液

  • 采集样品,4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
  • 分装上清液,并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

唾液

  • 采集样品,4℃ 下以 10,000 x g 离心 2分钟。

  • 分装上清液,并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

血清

  • 将全血收集在未处理的试管中,或例如,不含抗凝剂的试管中,如 BD Vacutainer 血清试管(目录号:367812)。
  • 室温下不受干扰地孵育 20 分钟。

  • 4℃ 下以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟。

  • 立即分装上清液(血清),并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

组织提取物

  • 使用干净的工具解剖目标组织,最好尽快置于冰上,以防被蛋白酶降解。
  • 将组织置于圆底微量离心管中,浸入液氮中“速冻”。在 -80℃ 下存储样品备用,或将样品置于冰上立即匀浆。

  • 对于约 5 mg 组织块,向试管中加入约 300 µL 完全提取缓冲液(参见细胞/组织提取缓冲液配方),并用电动匀浆器匀浆。

  • 每次使用 300 µL 完全提取缓冲液冲洗刀片两次,然后在 4℃ 下持续搅拌 2 小时(例如,置于冷藏室的轨道振荡器上)。

  • 在 4℃ 下以 13,000 rpm 的速度离心 20 分钟。置于冰上,将上清液(即为可溶性蛋白提取物)等分至新鲜、冷冻的试管中,并在 -80℃ 下存储样品。尽量减少冻融循环。



必须根据存在的组织量确定裂解缓冲液的体积。最终蛋白提取物的典型浓度 > 1 mg/m


细胞/组织提取缓冲液配方

  • 100 mM Tris, pH 7.4
  • 150 mM 氯化钠

  • 1 mM EGTA

  • 1 mM EDTA

  • 1% Triton X-100

  •  0.5% 脱氧胆酸钠

生产完全提取缓冲液所需的额外试剂。

  • 磷酸酶抑制剂混合物

  • 蛋白酶抑制剂混合物

  • PMSF



临用前,按照生产商所述,向细胞提取缓冲液中添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物,并添加 PMSF 1 mM


一般性建议

  • 建议蛋白提取物浓度至少为 1-2 mg/mL。
  • 通常,用结合缓冲液将血清、血浆、细胞和组织提取物稀释 50%。

解冻后,使用前,将样品在 4℃ 下以 10,000 rpm 的速度离心 5',以除去任何沉淀物。



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