直接流式细胞术实验方案

采用偶联一抗的流式细胞术的一般步骤。

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  1. 收集、清洗细胞，并用冰冷的 PBS、10% FCS、1% 叠氮化钠调节细胞悬液浓度至 1-5 x 106 细胞/mL。通常使用聚苯乙烯圆底 12 x 75 mm2 Falcon 管进行细胞染色。但是，任何可用于离心的容器均可用于细胞染色，例如试管、eppendorf 管以及 96 孔圆底微量滴定板。​一般而言，细胞应进行充分离心，以除去上清液并保证细胞损失最小，同时细胞容易重悬。​


    我们建议使用冰冷的试剂/溶液进行染色，或在 4 °C 条件下操作，因为低温和叠氮化钠的存在可以防止表面抗原的调节和内化。内化会导致荧光强度的损失。​
  2. 添加 0.1-10 μg/mL 偶联一抗。如有需要，可使用 3% BSA/PBS 稀释（也可在此时加入碘化丙啶以排除死细胞）。
  3. 在室温或 4°C 下避光培养 30 分钟。此步骤需要进行优化。
  4. 清洗细胞三次，并在 400 g 离心力下离心五分钟，然后重悬于 500 µL 至 1 mL 冰冷的 PBS、10% FCS 及 1% 叠氮化钠中。将细胞避光保存于冰上，或放入 4°C 冰箱中，待使用时再取出用于分析。
  5. ​​为获得最佳结果，应尽快使用流式细胞仪分析细胞。

我们建议当天进行分析。细胞的所需保存时间较长（16 小时）或需要配合细胞仪的分析计划时，可以使用 1% 多聚甲醛重悬细胞，以防坏死。

固定：

如果等待时间超过 1 个小时，可在步骤 3 后固定细胞。这样，细胞可以保存数天。（这可以使光散射更加稳定，并使大多数生物性危害因子失活）。

对照物也需采用相同步骤进行固定。如果需要保持细胞活力，则不要进行固定。固定方法有很多种，具体可参见间接染色实验方案的固定部分。不同抗原的固定步骤需要用户自行优化。 

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