直标流式细胞术实验方案

使用偶联一抗的流式细胞术的一般程序。

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1.       收集细胞，冲洗细胞，将细胞重悬于冰冷的 PBS、10% FCS、1% 叠氮化钠中，调整细胞悬液浓度至 1-5 x 10⁶ 个细胞/mL。通常在12 x 75 mm² 大小的聚苯乙烯圆底Falcon离心管中对细胞进行染色。如果您具有适当的离心机，也可在其他容器中对细胞进行染色，例如试管、Eppendorf 管和 96 孔圆底微量滴定板。一般说来，应该尽可能充分离心，保证去除上清液时的细胞损失较小，但是如果离心多度也会导致细胞难以重悬。

我们推荐使用冰冷的试剂/溶液，并且将细胞保存在 4 ℃ 的低温环境下，因为低温和叠氮化钠的存在可以抑制表面抗原的调节和内化作用，避免了荧光强度的降低。

2.       加入 0.1-10 μg/mL荧光偶联的一抗。如必要，使用 3% BSA/PBS（此时也可加入碘化丙啶，以排除死细胞）进行抗体稀释。

3.       在室温或 4 ℃ 下避光孵育至少 30 分钟。此步骤需要优化。

4.       将细胞在 400 g 离心 5 分钟，然后重悬于 500 µL 至 1 mL 冰冷的含有10% FCS、1% 叠氮化钠的PBS中进行洗涤，重复 3 次。将细胞放在冰上或在 4 ℃ 避光保存，直到按计划进行分析。

5.       为获得最佳结果，需尽快在流式细胞仪上分析细胞。

我们建议在当天分析。如果要长时间保存（16 小时）或者希望获得更高的灵活性以便于安排流式细胞仪检测时间，可将细胞重悬在 1% 多聚甲醛中以防变质。

固定：

如果您需要等待 1 小时以上，可能需要在步骤 3 之后固定细胞。这样可使细胞保留数天（可以使光散射稳定并使大部分有生物危害的试剂失活）。

对照也需要用同样的程序进行固定。如果细胞需要保持活力，则不应固定。固定方法有多种可使用，具体请参见间接染色实验方案中的关于细胞固定的部分。用户也需要针对不同抗原的固定进行方案优化。

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