为了使您在Abcam官网的浏览体验更顺畅,请使用最新版本的浏览器比如 Google Chrome
1. 收集细胞,冲洗细胞,将细胞重悬于冰冷的 PBS、10% FCS、1% 叠氮化钠中,调整细胞悬液浓度至 1-5 x 106 个细胞/mL。通常在12 x 75 mm2 大小的聚苯乙烯圆底Falcon离心管中对细胞进行染色。如果您具有适当的离心机,也可在其他容器中对细胞进行染色,例如试管、Eppendorf 管和 96 孔圆底微量滴定板。一般说来,应该尽可能充分离心,保证去除上清液时的细胞损失较小,但是如果离心多度也会导致细胞难以重悬。
我们推荐使用冰冷的试剂/溶液,并且将细胞保存在 4 ℃ 的低温环境下,因为低温和叠氮化钠的存在可以抑制表面抗原的调节和内化作用,避免了荧光强度的降低。
2. 加入 0.1-10 μg/mL荧光偶联的一抗。如必要,使用 3% BSA/PBS(此时也可加入碘化丙啶,以排除死细胞)进行抗体稀释。
3. 在室温或 4 ℃ 下避光孵育至少 30 分钟。此步骤需要优化。
4. 将细胞在 400 g 离心 5 分钟,然后重悬于 500 µL 至 1 mL 冰冷的含有10% FCS、1% 叠氮化钠的PBS中进行洗涤,重复 3 次。将细胞放在冰上或在 4 ℃ 避光保存,直到按计划进行分析。
5. 为获得最佳结果,需尽快在流式细胞仪上分析细胞。
我们建议在当天分析。如果要长时间保存(16 小时)或者希望获得更高的灵活性以便于安排流式细胞仪检测时间,可将细胞重悬在 1% 多聚甲醛中以防变质。
固定:
如果您需要等待 1 小时以上,可能需要在步骤 3 之后固定细胞。这样可使细胞保留数天(可以使光散射稳定并使大部分有生物危害的试剂失活)。
对照也需要用同样的程序进行固定。如果细胞需要保持活力,则不应固定。固定方法有多种可使用,具体请参见间接染色实验方案中的关于细胞固定的部分。用户也需要针对不同抗原的固定进行方案优化。