哺乳动物细胞系冷冻保存视频实验方案
冷冻保存是一种使细胞在冷冻数月或数年，并在解冻后仍保持其活力的方法。细胞冷冻保存可尽可能减少遗传变化并避免污染造成的损失。最好在细胞处于其最佳生长速率时将其冷冻保存。
甘油打印本实验方案
材料和试剂
- 冷冻培养基
CoolCell® 快速冷冻机 (BioCision)
冷冻培养基
冷冻保存
在冷冻管上标记好日期、研究者姓名、细胞数、细胞传代数和细胞类型（以及任何其他有用信息，比如遗传修饰）。
如果细胞贴壁，则去除细胞培养基，用 PBS 洗涤，加入足量胰蛋白酶覆盖细胞并在 37°C 培养箱中孵育约 2 分钟。在细胞培养基中重悬细胞并移入 50 mL Falcon 管中。
如果细胞为悬浮状态，只需将所需体积细胞直接移入 50 mL Falcon 管中。
用血细胞计数器进行细胞计数以确定其活力。用于冷冻保存的细胞活力至少应为 75%。
在室温下以 1,000 rpm 离心 5 分钟。
准备冷冻培养基（表 1）。
请注意，DMSO 并不适合所有的细胞类型，因此甘油可作为替代使用。去除上清液（上清液需要保留用于冷冻培养基，见表 1），轻轻散开沉淀物。
添加冷冻培养基至所需的细胞密度。对于哺乳动物细胞，所需细胞密度通常为 1,000,000/mL 冷冻培养基。在室温下，细胞不应在冷冻培养基中超过 10 分钟。
在各冷冻管中各分装 1 mL，并盖紧盖子。
室温下将冷冻管移至 CoolCell 快速冷冻机中，然后放入 -80°C 冰箱中。CoolCell 快速冷冻机将确保温度以 1°C/分钟稳步下降。
大约 24 小时后，从 CoolCell 快速冷冻机中取出冷冻管并转移到液氮中长期储存。
| 培养类型 | 冷冻培养基 | 注释 |
| 在含 FBS 的培养基中培养的细胞 | 90% FBS + 10% DMSO | 在使用前充分混合并升温至 37°C。 |
| 在无血清培养基中培养的细胞 | 90% 条件培养基 + 10% DMSO | 使用离心步骤中的上清液（步骤 7）。 在使用前充分混合并升温至 37°C。 |
| 需要用甘油冷冻的细胞 | 90% FBS + 10% 甘油 | 在使用前充分混合并升温至 37°C。 |
表 1.用于哺乳动物细胞系的不同类型冷冻培养基
将冷冻细胞系解冻
- 从液氮储存中取出冷冻管并置于 37°C 水浴中，直至仅约 80% 解冻。这一步骤应该不超过 1 分钟。
- 使用移液管将冷冻管内容物转移到含有约 10 mL 预热培养基的 15 mL Falcon 管中。
- 以 500–1,000 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，在适量细胞培养基中重悬细胞。
- 将细胞转移到培养皿中并放入 37°C 培养箱中。
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