用于交联染色质免疫沉淀的 ChIP 方案 (X-ChIP)

使用 ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 方法交联 ChIP 的详细步骤和技巧。 

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ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 功能强大,可以实现蛋白质或组蛋白修饰与基因组区域的特异性匹配。分离染色质,使用针对目的抗原的抗体来确定靶标是否与特定的 DNA 序列结合或绘制整个基因组的分布图(微阵列或 DNA 测序)。这可以在空间和时间上进行。本方案提供了如何在细胞上进行 ChIP 的具体细节。

使用本方案产生的输出 DNA 既可以在 ChIP-qPCR 中使用 qPCR 分析,也可以在 ChIP-seq 中测序。


更多 ChIP 资源和产品

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- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500,或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。



  1. 交联和细胞收获



    甲醛用于蛋白质与 DNA 的交联。交联是一种时间依赖性程序,需要优化。我们建议将样品交联 2 至 30 分钟。过度交联会降低抗原的可及性和超声处理效率。表位也可能被掩盖。加入甘氨酸淬灭甲醛,终止交联反应。


    1. 从两个 confluent 150 cm2 培养皿开始(每皿 1 × 107–5 × 107 个细胞)。通过直接向培养基中逐滴滴加甲醛,直至终浓度为 0.75%,并在室温 (RT) 下轻轻旋转 10 分钟,将蛋白质与 DNA 交联。
    2. 向培养基中添加甘氨酸,直至终浓度为 125 mM,室温振荡孵育 5 分钟。
    3. 用 10 mL 冷 PBS 冲洗细胞两次。
    4. 加入 5 mL 冷 PBS,用细胞刮刀彻底刮去培养皿,移入 50 mL 管中。
    5. 向培养皿中添加 3 mL PBS,再次刮片,将剩余细胞转移至 50 mL 管中。
    6. 离心 5 分钟,4°C,1,000 xg。
    7. 小心吸取上清液,将沉淀重悬于 ChIP 裂解缓冲液中(每 1 x 107 个细胞 750 μL),冰上孵育 10 分钟。​


      使用悬浮细胞时,从 1 × 107–5 × 107 个细胞开始,如上所述,用 0.75% 甲醛和甘氨酸处理(步骤 1)。离心沉淀细胞(5 分钟,1,000 xg)。用冷 PBS 清洗 3 次,用 ChIP 裂解缓冲液重悬沉淀(每 1x107 个细胞 750 μL)。继续步骤 2。


  2. 超声处理

    1. 超声处理裂解液,剪切 DNA,使平均片段大小为 200-1000 bp。这一操作需要进一步优化,因为不同细胞系需要的超声处理时间不同。

      应对交联裂解物进行一段时间的超声处理,以确定最佳条件。应在整个时间进程中取出样品,并按照步骤 3 所述分离 DNA。应在 1.5% 琼脂糖凝胶上分析片段大小,如图 1 所示。


    2. 超声处理后,离心 10 分钟,4°C,8,000 xg,沉淀细胞碎片,转移上清液至新管中。该染色质制备液将用于步骤 4 中的免疫沉淀 (IP)。
    3. 取 50 μL 超声处理后的各样品,测定 DNA 浓度和片段大小。​


      超声处理后的染色质可在液氮中速冻,并在 -80°C 条件下保存长达 3 个月。避免多次冻融。


  3. DNA 浓度和片段大小的测定

    1. 超声处理后的染色质样品可用于计算后续 IPs 的 DNA 浓度,并测量 DNA 片段大小。在 50 µL 染色质中加入 70 µL 洗脱缓冲液。
    2. 加入 4.8 µL 5M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL),在 65°C 条件下振摇孵育过夜。
    3. 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL),60°C 条件下振摇培养 1 小时。​


      使用 PCR 纯化试剂盒时,高水平的 RNA 会干扰 DNA 纯化,因此使用 RNase A 处理样本。色谱柱饱和时,收率会严重降低。

      用蛋白酶 K 处理样品,该酶裂解邻近脂肪族和芳香族氨基酸羧基的肽键。蛋白质和 DNA 之间的交联被破坏,有助于 DNA 的纯化。


    4. 使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚:氯仿抽提纯化 DNA。
    5. 为测定 DNA 浓度,取 5 μL 纯化 DNA,转移至含 995 μL TE 的试管中,稀释 200 倍,读取 OD260。DNA 浓度 (μg/mL) 为 OD260 × 10,000。用于计算染色质制备液的 DNA 浓度。在含 100 bp DNA 标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶中运行纯化 DNA,以测定片段大小。
  4. 免疫沉淀

    1. 使用步骤 2.2 制备的染色质。建议每个 IP 约含 25 μg DNA。用 RIPA 缓冲液按 1:10 的比例稀释每份样品。您将需要一份用于特异性抗体的样本,一份用于对照品(仅限微珠)的样本。取出 50 µL 染色质作为您的输入样本,在 -20°C 条件下保存备用。
    2. 除仅含微珠的对照品外,在所有样品中加入一抗,在 4°C 条件下旋转 1 小时。加入的抗体量应根据经验确定;通常每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗体效果良好。
    3. 蛋白 A/G 微珠的制备:如果同时使用蛋白 A 和蛋白 G 微珠,混合等体积的蛋白 A 和蛋白 G 微珠,在 RIPA 缓冲液中清洗 3 次。吸取 RIPA 缓冲液,加入单链鲱鱼精 DNA,直至微珠终浓度为 75 ng/μL,加入 BSA,直至微珠终浓度为 0.1 μg/μL。加入 RIPA 缓冲液至微珠体积的 2 倍,室温旋转孵育 30 分钟。用 RIPA 缓冲液清洗一次,加入 RIPA 缓冲液至微珠体积的两倍。
    4. 在所有样品中加入 60 µL 封闭的蛋白 A/G 微珠,4°C 旋转 IP 过夜。​


      应使用蛋白 A 微珠、蛋白 G 微珠或两者的混合物。表 1 显示了蛋白 A 和 G 微珠与不同免疫球蛋白同种型的亲和力。


    5. 将免疫沉淀样品以 2,000 xg 离心 1 分钟,除去上清液。
    6. 进行以下清洗:在低盐洗涤缓冲液中清洗一次,在高盐洗涤缓冲液中清洗一次,在 LiCl 洗涤缓冲液中清洗一次。每次清洗后,以 2,000 xg 离心 1 分钟,去除上清液。​



      如果观察到高背景,可能需要额外清洗。或者,在步骤 4.2 之前,与蛋白 A/G 微珠孵育 1 小时,预清除超声处理的染色质。该附加步骤将去除与微珠的任何非特异性结合。将上清液(经超声处理的染色质)转移到新试管中,并按照步骤 4.2 中所述与抗体和微珠一起孵育。
  5. 交联的洗脱和逆转

    1. 在蛋白 A/G 微珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液,洗脱 DNA,30°C 缓慢涡旋 15 分钟。
    2. 以 2,000 xg 离心 1 分钟,将上清液转移至新鲜管中。
    3. 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL),在 65°C 条件下振摇孵育过夜。
    4. 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL),60°C 条件下振摇孵育 1小时。
    5. 可使用 PCR 纯化试剂盒或酚:氯仿抽提纯化 DNA。
  6. ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 中的分析

    1. DNA 水平常采用实时定量 PCR 法检测。通常使用实时 PCR 仪提供的软件或在线设计工具设计引物和探针。我们的网站上有一些预先设计的引物和探针。
    2. 或者,使用 ChIP-seq 方法时,可通过测序进行分析。使用本方案产生的 DNA 适合用作测序库制备的输入。

我们建议您使用我们的疑难解析提示,针对您的特定实验条件优化本方案。

图 1. 超声处理 U2OS 细胞 5、10、15 和 20 分钟。片段大小在时间过程中减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。注:超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用,因此条带大小应不小于 200 bp。​

免疫球蛋白同型

种属   免疫球蛋白同种型蛋白 A蛋白 G
人                    IgG1++++++
                       IgG2++++++
                       IgG3-+++
                      IgG4++++++
                      IgM使用抗人 IgM 使用抗人 IgM 
                       IgE-+
                       IgA-+
小鼠               IgG1++++
                      IgG2a++++++
                      IgG2b++++
                       IgG3++
                       IgM使用抗人 IgM使用抗人IgM
Rat                 IgG1-+
                       IgG2a-+++
                       IgG2b-++
                       IgG2c+++
           所有同种型-++
奶牛       所有同种型+++++
山羊       所有同种型-++
豚鼠       所有同种型+++++
仓鼠      所有同种型+++
          所有同种型+++++
          所有同种型+++
          所有同种型+++++
绵羊       所有同种型-++

表 1. 蛋白 A 和 G 微珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。

溶液

ChIP 裂解缓冲液

50 mM HEPES-KOH pH7.5

140 mM 氯化钠

1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH8

1% Triton X-100

0.1% 脱氧胆酸钠

0.1% SDS

蛋白酶抑制剂(每次加入新鲜抑制剂)

RIPA 缓冲液

50 mM Tris-HCl pH8

150 mM 氯化钠

2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH8

1% NP-40

0.5% 脱氧胆酸钠

0.1% SDS

蛋白酶抑制剂(每次加入新鲜抑制剂)

低盐清洗缓冲液

0.1% SDS

1% Triton X-100

2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

20 mM Tris-HCl pH 8.0

150 mM 氯化钠

高盐清洗缓冲液

0.1% SDS

1% Triton X-100

2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

20 mM Tris-HCl pH 8.0

500 mM 氯化钠

LiCl 清洗缓冲液

0.25 M 氯化锂

1% NP-40

1% 脱氧胆酸钠

1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

10 mM Tris-HCl pH 8.0

TE 缓冲液

10 mM Tris pH 8.0

1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

洗脱缓冲液
1% SDS    
100mM NaHCO3  


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