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通过 ChIP-seq 法和 ChIP-qPCR 法开展交联 ChIP 的详细步骤和技巧。
2021 年 11 月 9 日审核
ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 功能强大,可实现蛋白或组蛋白修饰与基因组区域的特异性匹配。分离染色质后,使用靶向目标抗原的抗体确定靶点是否与特定的 DNA 序列结合或绘制整个基因组的分布图(微阵列或 DNA 测序)。该步骤在空间和时间上均可行。
该方案提供了如何在细胞上进行 ChIP 的具体细节。使用该方案产生的输出 DNA 既可以采用 qPCR (ChIP-qPCR) 分析,也可以进行测序 (ChIP-seq) 分析。
用福尔马林交联蛋白质和 DNA。交联程序与时间有关,需要优化。
提示:样本的建议交联时间为 2 - 30 分钟。过度交联会降低抗原的可及性及超声效果。表位也可能被掩盖。加入甘氨酸封闭福尔马林,终止交联反应。
1.1 首先,准备两个 150 cm2 长满细胞的培养皿(每个培养皿 1x107 - 5x107 个细胞)。直接向培养基中逐滴滴加福尔马林,至终浓度为 0.75%,然后在室温 (RT) 下轻柔旋转 10 分钟,促使蛋白质与 DNA 交联。
1.2 向培养基中添加甘氨酸,至终浓度为 125 mM,室温下振荡孵育 5 分钟。
1.3 用 10 mL 冰冷 PBS 冲洗细胞两次。
1.4 加入 5 mL 冰冷 PBS,用细胞刮刀刮下培养皿,移入 50 mL 试管中。
1.5 向培养皿中添加 3 mL PBS,再次刮片,将剩余细胞转移至 50 mL 试管中。
1.6 4°C 下,按照 1,000 xg 的转速离心 5 分钟。
1.7 小心吸取上清液,将沉淀重悬于 ChIP 裂解缓冲液中(每 1 x 107 个细胞 750 μL),置于冰上孵育 10 分钟。
提示:悬浮细胞的起始用量为 1 x 107 - 5 x 107 个细胞,如上所述用 0.75% 福尔马林和甘氨酸处理细胞(步骤 1)。离心沉淀细胞(5 分钟,1,000 xg)。用冰冷 PBS 洗涤 3 次,并用 ChIP 裂解缓冲液重悬沉淀(750 μL/1 x 107 个细胞)。
2.1 对裂解液进行超声处理,以剪切 DNA,并确保 DNA 的平均片段大小为 200-1000 bp。不同细胞系所需的超声处理时间不同,因此这一步骤需要优化。
提示:为了确定最佳条件,应对交联裂解液进行一个时程的超声处理。时程结束后,取出样本,并按照步骤 3 所述分离 DNA。应在 1.5% 琼脂糖凝胶上分析片段大小,如图 1 所示。
2.2 超声处理完成后,在 4°C 下按照 8,000 xg 的转速离心 10 分钟,沉淀细胞碎片,转移上清液至新管中。该染色质溶液将用于步骤 4 免疫沉淀 (IP) 中。
2.3 取 50 μL 经超声处理的样本,测定 DNA 浓度和片段大小。
提示:经超声处理的染色质可在液氮中速冻保存,可在 -80°C 下保存 3 个月之久。请勿反复冻融。
图 1(如上):对 U2OS 细胞进行 5、10、15 和 20 分钟的超声处理。片段大小随着超声时间的增加而减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。
提示:超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用,因此条带大小应不小于 200 bp。
经过超声处理的染色质样本可用于计算后续 IP 的 DNA 浓度,并测定 DNA 片段大小。
3.1 向 50 µL 染色质中加入 70 µL 洗脱缓冲液。
3.2 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL),65°C 下振摇孵育过夜。
为什么使用 RNase A?
使用 PCR 纯化试剂盒时,高水平的 RNA 会干扰 DNA 纯化,因此需要使用 RNase A 处理样本。否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。
3.3 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL),60°C 下振摇孵育 1 小时。
为什么使用蛋白酶 K?
用蛋白酶 K 处理样本,可使邻近脂肪与芳香族氨基酸羧基的肽键断裂。从而破坏蛋白质和 DNA 之间的交联,促进 DNA 的纯化。
3.4 使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚:氯仿萃取法纯化 DNA。
3.5 为测定 DNA 浓度,取 5 μL 纯化 DNA,转移至含 995 μL TE 的试管中,稀释 200 倍,并读取 OD260。DNA 浓度 (μg/mL) 为 OD260 x 10,000。用于计算制备染色质的 DNA 浓度。在带 100 bp DNA 标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶中运行纯化 DNA,以测定片段大小。
4.1 使用步骤 2.2 制备的染色质。建议每次 IP 使用约 25 μg DNA。按 1:10 的比例用 RIPA 缓冲液稀释每个样本。设置一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。取 50 µL 染色质作为 input 样本,-20°C 下保存备用。
4.2 在所有样本(仅加磁珠的对照除外)中加入一抗,并在 4°C 下旋转孵育 1 小时。抗体用量应事先通过实验确定;一般来说,每 25 μg DNA 加入 1 - 10 μg 抗体。
4.3 制备蛋白 A/G 磁珠:如果同时使用蛋白 A 和蛋白 G 磁珠,混合等体积的蛋白 A 和蛋白 G 磁珠,在 RIPA 缓冲液中洗涤 3 次。吸取 RIPA 缓冲液,加入单链鲱鱼精 DNA,至磁珠终浓度为 75 ng/μL,再加入 BSA,至磁珠终浓度为 0.1 μg/μL。加入 RIPA 缓冲液,至磁珠体积翻倍,室温下旋转孵育 30 分钟。用 RIPA 缓冲液洗涤一次,加入 RIPA 缓冲液,至磁珠体积翻倍。
4.4 在所有样本中加入 60 µL 封闭的蛋白 A/G 磁珠,4°C 下旋转 IP 过夜。
提示:应使用蛋白 A 磁珠、蛋白 G 磁珠或两种磁珠的混合物。表 1 显示了蛋白 A 和 G 磁珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。
4.5 按照 2,000 xg 的转速离心免疫沉淀样本 1 分钟,除去上清液。
4.6 按照以下步骤进行洗涤:分别在低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液和氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。每次洗涤后,按照 2,000 xg 的转速离心 1 分钟,除去上清液。
提示:如果观察到高背景,可能需要额外增加洗涤步骤。也可以在实施步骤 4.2 之前,用蛋白 A/G 磁珠孵育 1 小时,从而预先清除经过超声处理的染色质。该步骤可以去除与磁珠发生的非特异性结合。将上清液(经过超声处理的染色质)转移至一个新管中,然后按照前述步骤 4.2 对抗体和磁珠进行孵育。
5.1 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液,以洗脱 DNA,30°C 下缓慢涡旋 15 分钟。
5.2 按照 2,000 xg 的转速离心 1 分钟,并将上清液转移至新管中。
5.3 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL),65°C 下振摇孵育过夜。
5.4 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL),60°C 下振摇孵育 1 小时。
5.5 DNA 可使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取法进行纯化。
6.1 DNA 水平通常采用实时定量 PCR 法进行测定。引物和探针通常使用实时 PCR 仪提供的软件或在线设计工具进行设计。我们在网站上提供了一些预先设计好的引物和探针。
6.2 使用 ChIP-seq 方法时,也可以通过测序进行 DNA 水平分析。使用该方案产生的 DNA 适合用作制备测序文库的 input。
提示:建议根据我们的疑难解答提示优化该方案,确保其适用于您的特定实验条件。
种属 | 免疫球蛋白同种型 | 蛋白 A 结合强度 | 蛋白 G 结合强度 |
人 | IgG1 | +++ | +++ |
IgG2 | +++ | +++ | |
IgG3 | - | +++ | |
IgG4 | +++ | +++ | |
IgM | 使用人 IgM | 使用人 IgM | |
IgE | - | + | |
| IgA | - | + |
小鼠 | IgG1 | + | +++ |
IgG2a | +++ | +++ | |
IgG2b | ++ | ++ | |
IgG3 | + | + | |
IgM | 使用人 IgM | 使用人 IgM | |
大鼠 | IgG1 | - | + |
IgG2a | - | +++ | |
IgG2b | - | ++ | |
IgG2c | + | ++ | |
鸡 | 所有同种型 | - | ++ |
母牛 | 所有同种型 | ++ | +++ |
山羊 | 所有同种型 | - | ++ |
豚鼠 | 所有同种型 | +++ | ++ |
仓鼠 | 所有同种型 | + | ++ |
马 | 所有同种型 | ++ | +++ |
猪 | 所有同种型 | + | ++ |
兔 | 所有同种型 | +++ | ++ |
羊 | 所有同种型 | - | ++ |