用于交联染色质免疫沉淀的 ChIP 方案 (X-ChIP)
Related
通过 ChIP-seq 法和 ChIP-qPCR 法开展交联 ChIP 的详细步骤和技巧。
2021 年 11 月 9 日审核
简介
ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 功能强大，可实现蛋白或组蛋白修饰与基因组区域的特异性匹配。分离染色质后，使用靶向目标抗原的抗体确定靶点是否与特定的 DNA 序列结合或绘制整个基因组的分布图（微阵列或 DNA 测序）。该步骤在空间和时间上均可行。
该方案提供了如何在细胞上进行 ChIP 的具体细节。使用该方案产生的输出 DNA 既可以采用 qPCR (ChIP-qPCR) 分析，也可以进行测序 (ChIP-seq) 分析。
目录
- 试剂
- DNA-蛋白质交联和收获细胞
- 对细胞裂解液进行超声处理，以分离染色质
- 计算 DNA 浓度，测定 DNA 片段大小
- 染色质免疫沉淀
- 洗脱并逆转 DNA 交联
- 在 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 中分析 DNA 水平
- 附录：缓冲液配方
- 附录：蛋白 A 和 G 磁珠对各种属不同免疫球蛋白同种型的亲和力
试剂
- 福尔马林甘氨酸
- 冷的 PBS
- ChIP 裂解缓冲液（配方见附录：溶液）
- 洗脱缓冲液（配方见附录：溶液）
- 氯化钠 (NaCL)
- RNase
- 蛋白酶 K
- 用于苯酚：氯仿萃取的 PCR 纯化试剂盒或材料
- Tris-EDTA (TE)
- 带 100 bp DNA 标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶
- RIPA 缓冲液（配方见附录：溶液）
- 一抗
- 蛋白 A/G：蛋白 A 磁珠、蛋白 G 磁珠、RIPA 缓冲液、单链鲱鱼精 DNA
- 低盐洗涤缓冲液（配方见附录：溶液）
- 高盐洗涤缓冲液（配方见附录：溶液）
- 氯化锂 (LiCl) 洗涤缓冲液（配方见附录：溶液）
方法
1.DNA-蛋白质交联和收获细胞
用福尔马林交联蛋白质和 DNA。交联程序与时间有关，需要优化。
提示：样本的建议交联时间为 2 - 30 分钟。过度交联会降低抗原的可及性及超声效果。表位也可能被掩盖。加入甘氨酸封闭福尔马林，终止交联反应。
1.1 首先，准备两个 150 cm2 长满细胞的培养皿（每个培养皿 1x107 - 5x107 个细胞）。直接向培养基中逐滴滴加福尔马林，至终浓度为 0.75%，然后在室温 (RT) 下轻柔旋转 10 分钟，促使蛋白质与 DNA 交联。
1.2 向培养基中添加甘氨酸，至终浓度为 125 mM，室温下振荡孵育 5 分钟。
1.3 用 10 mL 冰冷 PBS 冲洗细胞两次。
1.4 加入 5 mL 冰冷 PBS，用细胞刮刀刮下培养皿，移入 50 mL 试管中。
1.5 向培养皿中添加 3 mL PBS，再次刮片，将剩余细胞转移至 50 mL 试管中。
1.6 4°C 下，按照 1,000 xg 的转速离心 5 分钟。
1.7 小心吸取上清液，将沉淀重悬于 ChIP 裂解缓冲液中（每 1 x 107 个细胞 750 μL），置于冰上孵育 10 分钟。
提示：悬浮细胞的起始用量为 1 x 107 - 5 x 107 个细胞，如上所述用 0.75% 福尔马林和甘氨酸处理细胞（步骤 1）。离心沉淀细胞（5 分钟，1,000 xg）。用冰冷 PBS 洗涤 3 次，并用 ChIP 裂解缓冲液重悬沉淀（750 μL/1 x 107 个细胞）。
2.对细胞裂解液进行超声处理，以分离染色质
2.1 对裂解液进行超声处理，以剪切 DNA，并确保 DNA 的平均片段大小为 200-1000 bp。不同细胞系所需的超声处理时间不同，因此这一步骤需要优化。
提示：为了确定最佳条件，应对交联裂解液进行一个时程的超声处理。时程结束后，取出样本，并按照步骤 3 所述分离 DNA。应在 1.5% 琼脂糖凝胶上分析片段大小，如图 1 所示。
2.2 超声处理完成后，在 4°C 下按照 8,000 xg 的转速离心 10 分钟，沉淀细胞碎片，转移上清液至新管中。该染色质溶液将用于步骤 4 免疫沉淀 (IP) 中。
2.3 取 50 μL 经超声处理的样本，测定 DNA 浓度和片段大小。
提示：经超声处理的染色质可在液氮中速冻保存，可在 -80°C 下保存 3 个月之久。请勿反复冻融。
图 1（如上）：对 U2OS 细胞进行 5、10、15 和 20 分钟的超声处理。片段大小随着超声时间的增加而减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。
提示：超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用，因此条带大小应不小于 200 bp。
3.计算 DNA 浓度，并测定 DNA 片段大小
经过超声处理的染色质样本可用于计算后续 IP 的 DNA 浓度，并测定 DNA 片段大小。
3.1 向 50 µL 染色质中加入 70 µL 洗脱缓冲液。
3.2 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL)，65°C 下振摇孵育过夜。
为什么使用 RNase A？
使用 PCR 纯化试剂盒时，高水平的 RNA 会干扰 DNA 纯化，因此需要使用 RNase A 处理样本。否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。
3.3 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 下振摇孵育 1 小时。
为什么使用蛋白酶 K？
用蛋白酶 K 处理样本，可使邻近脂肪与芳香族氨基酸羧基的肽键断裂。从而破坏蛋白质和 DNA 之间的交联，促进 DNA 的纯化。
3.4 使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚：氯仿萃取法纯化 DNA。
3.5 为测定 DNA 浓度，取 5 μL 纯化 DNA，转移至含 995 μL TE 的试管中，稀释 200 倍，并读取 OD260。DNA 浓度 (μg/mL) 为 OD260 x 10,000。用于计算制备染色质的 DNA 浓度。在带 100 bp DNA 标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶中运行纯化 DNA，以测定片段大小。
4.染色质免疫沉淀（IP）
4.1 使用步骤 2.2 制备的染色质。建议每次 IP 使用约 25 μg DNA。按 1:10 的比例用 RIPA 缓冲液稀释每个样本。设置一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。取 50 µL 染色质作为 input 样本，-20°C 下保存备用。
4.2 在所有样本（仅加磁珠的对照除外）中加入一抗，并在 4°C 下旋转孵育 1 小时。抗体用量应事先通过实验确定；一般来说，每 25 μg DNA 加入 1 - 10 μg 抗体。
4.3 制备蛋白 A/G 磁珠：如果同时使用蛋白 A 和蛋白 G 磁珠，混合等体积的蛋白 A 和蛋白 G 磁珠，在 RIPA 缓冲液中洗涤 3 次。吸取 RIPA 缓冲液，加入单链鲱鱼精 DNA，至磁珠终浓度为 75 ng/μL，再加入 BSA，至磁珠终浓度为 0.1 μg/μL。加入 RIPA 缓冲液，至磁珠体积翻倍，室温下旋转孵育 30 分钟。用 RIPA 缓冲液洗涤一次，加入 RIPA 缓冲液，至磁珠体积翻倍。
4.4 在所有样本中加入 60 µL 封闭的蛋白 A/G 磁珠，4°C 下旋转 IP 过夜。
提示：应使用蛋白 A 磁珠、蛋白 G 磁珠或两种磁珠的混合物。表 1 显示了蛋白 A 和 G 磁珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。
4.5 按照 2,000 xg 的转速离心免疫沉淀样本 1 分钟，除去上清液。
4.6 按照以下步骤进行洗涤：分别在低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液和氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。每次洗涤后，按照 2,000 xg 的转速离心 1 分钟，除去上清液。
提示：如果观察到高背景，可能需要额外增加洗涤步骤。也可以在实施步骤 4.2 之前，用蛋白 A/G 磁珠孵育 1 小时，从而预先清除经过超声处理的染色质。该步骤可以去除与磁珠发生的非特异性结合。将上清液（经过超声处理的染色质）转移至一个新管中，然后按照前述步骤 4.2 对抗体和磁珠进行孵育。
5.洗脱并逆转 DNA 交联
5.1 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液，以洗脱 DNA，30°C 下缓慢涡旋 15 分钟。
5.2 按照 2,000 xg 的转速离心 1 分钟，并将上清液转移至新管中。
5.3 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL)，65°C 下振摇孵育过夜。
5.4 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 下振摇孵育 1 小时。
5.5 DNA 可使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取法进行纯化。
6.在 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 中分析 DNA 水平
6.1 DNA 水平通常采用实时定量 PCR 法进行测定。引物和探针通常使用实时 PCR 仪提供的软件或在线设计工具进行设计。我们在网站上提供了一些预先设计好的引物和探针。
6.2 使用 ChIP-seq 方法时，也可以通过测序进行 DNA 水平分析。使用该方案产生的 DNA 适合用作制备测序文库的 input。
提示：建议根据我们的疑难解答提示优化该方案，确保其适用于您的特定实验条件。
附录：缓冲液配方
ChIP 裂解缓冲液
- 50 mM HEPES-KOH pH7.5
- 140 mM 氯化钠
- 1 mM EDTA pH 8
- 1% Triton X-100
- 0.1% 脱氧胆酸钠
- 0.1% SDS
- 蛋白酶抑制剂（每次加入新制备的抑制剂）
RIPA 缓冲液
- 50 mM Tris-HCl pH8
- 150 mM 氯化钠
- 2 mM EDTA pH 8
- 1% 乙基苯基聚乙二醇
- 0.5% 去氧胆酸钠
- 0.1% SDS
- 蛋白酶抑制剂（每次加入新制备的抑制剂）
低盐洗涤缓冲液
- 0.1% SDS
- 1% Triton X-100
- 2 mM EDTA
- 20 mM Tris-HCl pH 8.0
- 150 mM 氯化钠
高盐洗涤缓冲液
- 0.1% SDS
- 1% Triton X-100
- 2 mM EDTA
- 20 mM Tris-HCl pH 8.0
- 500 mM 氯化钠
LiCl 洗涤缓冲液
- 0.25 M 氯化锂
- 1% NP-40
- 1% 去氧胆酸钠
- 1 mM EDTA
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0
TE 缓冲液
- 10 mM Tris pH 8.0
- 1 mM EDTA
洗脱缓冲液
- 1% SDS
- 100 mM NaHCO3
附录：蛋白 A 和 G 磁珠对各种属不同免疫球蛋白同种型的亲和力
种属 | 免疫球蛋白同种型 | 蛋白 A 结合强度 | 蛋白 G 结合强度 |
人 | IgG1 | +++ | +++ |
IgG2 | +++ | +++ | |
IgG3 | - | +++ | |
IgG4 | +++ | +++ | |
IgM | 使用人 IgM | 使用人 IgM | |
IgE | - | + | |
| IgA | - | + |
小鼠 | IgG1 | + | +++ |
IgG2a | +++ | +++ | |
IgG2b | ++ | ++ | |
IgG3 | + | + | |
IgM | 使用人 IgM | 使用人 IgM | |
大鼠 | IgG1 | - | + |
IgG2a | - | +++ | |
IgG2b | - | ++ | |
IgG2c | + | ++ | |
鸡 | 所有同种型 | - | ++ |
母牛 | 所有同种型 | ++ | +++ |
山羊 | 所有同种型 | - | ++ |
豚鼠 | 所有同种型 | +++ | ++ |
仓鼠 | 所有同种型 | + | ++ |
马 | 所有同种型 | ++ | +++ |
猪 | 所有同种型 | + | ++ |
兔 | 所有同种型 | +++ | ++ |
羊 | 所有同种型 | - | ++ |