有关胶原蛋白的实验方案技巧

三重螺旋结构在不同类型的胶原蛋白中很常见,这让胶原蛋白成为很难研究的靶标。我们在此提供使用注意事项和技巧能帮助您从胶原蛋白抗体得到预期的结果。

胶原蛋白抗体

​​胶原蛋白是高度保守的蛋白质,其特征为连续的甘氨酸-X-Y 三联体重复序列,从而形成三重螺旋结构。不同类型的胶原蛋白中这种三重螺旋结构相似度很高,很难构建某种胶原蛋白的特异性抗体。


为了使某一种胶原蛋白抗体具有特异性,生成抗体所用的免疫原必须依赖于未变性的三维胶原蛋白表位或者仅存在于特异性胶原蛋白中的较短多肽序列。您需要根据所用的抗体类型对实验方案进行相应的调整。 

请查看下列实验方案和注意事项

  • 胶原蛋白提取
  • 识别未变性三维胶原蛋白的抗体
  • 识别短肽序列的抗体
  • 选择合适的抗体
胶原蛋白是高度保守的蛋白质,其特征为连续的甘氨酸-X-Y 三联体重复序列,从而形成三重螺旋结构。不同类型的胶原蛋白中这种三重螺旋结构相似度很高,很难构建某种胶原蛋白的特异性抗体。

为了使某一种胶原蛋白抗体具有特异性,生成抗体所用的免疫原必须依赖于未变性的三维胶原蛋白表位或者仅存在于特异性胶原蛋白中的较短多肽序列。您需要根据所用的抗体类型对实验方案进行相应的调整。 

请查看下列实验方案和注意事

​​ 1.人结肠组织的福尔马林固定、石蜡包埋切片,用 ab138492 对胶原蛋白 I 染色(左上)。人关节软骨细胞的免疫荧光分析,用 ab34712 对胶原蛋白 II 染色(右上)。小鼠结肠肿瘤细胞 ICC,用 Ab21286对胶原蛋白 I 染色(红色)(左下)。石蜡包埋人肝组织的免疫组织化学分析,用 ab182744 标记胶原蛋白 VI(右下)。


胶原提取

常用的胶原蛋白提取主要有三大类型。

  1. 1.     盐析提取 用于盐溶性胶原蛋白
    通过逐步加入氯化钠,在中性盐溶液中提取。
    例如,0.45M NaCl,在搅拌条件下于 pH 7.5 保持 24 小时
  2. 2.     酸提取 用于酸溶性胶原蛋白
    在乙酸等有机酸中提取。
    例如,0.5M 醋酸,在 pH 2.5 下保持 24 小时
  3. 3.     酶提取 用于胃蛋白酶可溶的胶原蛋白
    在添加有胃蛋白酶的有机酸中提取。 
    例如,0.5M 醋酸中的 0.1% (w/v) 胃蛋白酶,在 pH 2.5 下保持 48 小时

​​ 2.提取的可溶性胶原蛋白片段的数据比较。2修改 Mocan E.Tagadiuc O.Nacu V. (2011) Aspects of collagen isolation procedure. Clin.Res.Studies 2, 35

 

通过盐沉淀提取得到的胶原蛋白水平低(图 2)。因此,通常优选通过酸处理法或酶处理法用胃蛋白酶分离胶原蛋白是最有效的方法,因为它能去除胶原蛋白的非螺旋末端,提高胶原蛋白的可溶性。但是,提取的胶原蛋白可能会被部分消化,因为胃蛋白酶能剪切包含了分子间交联的末端非螺旋区域。

展开的三重螺旋结构对温度敏感。因此,在胶原蛋白提取过程中保持低温很重要,可避免降解和变性。

识别未变性三维胶原蛋白的抗体的实验方案注意事项

 如果您正在使用通过未变性三维表位而研发的抗体(例如,ab34710),那么在实验过程中必须要小心避免胶原蛋白的变性。如果胶原蛋白变性或者使用了福尔马林固定、石蜡包埋的组织,抗体的反应性会降低。如果抗体识别未变性三维胶原蛋白,会在该抗体的数据表上说明,所以请务必事先查阅抗体说明书此处为您提供了一些关于如何在调整实验方案时考虑这一点的建议。

 

ELISA
使用具有天然三维结构的胶原蛋白标准品。
由于胶原蛋白序列的高度相似性,只有三级结构才具有足够的差异以区分不同类型的胶原蛋白。因此,胶原蛋白特异性抗体根据天然结构的存在情况进行特异性检测,并且应当使用具有天然三维结构的胶原蛋白标准品。

 

推荐使用夹心 ELISA
对于特异性识别未变性三维表位的胶原蛋白抗体,推荐使用夹心 ELISA,因为这种方法能保持天然胶原蛋白结构。

不推荐使用间接 ELISA,因为直接连接到 ELISA 板时胶原蛋白的天然结构会被破坏,可能导致抗体失去特异性。

蛋白质印迹WB
注意 pH、温度和浓度,防止胶原蛋白聚合。 
胶原蛋白在酸性条件下可溶,所以酸性 pH 对胶原蛋白的稳定性和可溶性至关重要。在碱性 pH 下,胶原蛋白会聚合形成凝胶。如果所用的胶原蛋白浓度太高,也会导致凝胶的形成。同样,由于胶原蛋白比其他蛋白质更不稳定,检测应在 <10 下进行。

 

优化电泳条件
> 向样品中加入洗涤剂、还原剂和离液剂。
胶原蛋白 IIIIII 使用 6% 的丙烯酰胺凝胶。
胶原蛋白 IVVVI 使用 10% 的丙烯酰胺凝胶。此外,梯度凝胶可能更适合用于展示全长片段和更小的片段。

注意:我们推荐使用天然蛋白质标准品作为阳性和阴性对照。

推荐抗体稀释度:0.5-1ug/mL

 

免疫组织化学IHC - 福尔马林固定、石蜡包埋
确定交联程度,并选择合适的抗原修复条件
当胶原蛋白的三重螺旋排列形成纤丝进而形成纤维时,胶原蛋白中可能发生交联。交联程度各异,这将决定暴露表位所需的抗原修复条件。天狼星红 (ab150681) 特异性结合到纤维胶原蛋白(IV 型)的 [gly-X-Y]n 螺旋结构上,因此可用于确定胶原蛋白的交联程度。

若可能,应尽可能地减少严苛的抗原修复条件,避免破坏胶原蛋白的三级结构。我们推荐用柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 进行抗原修复,但酶消化也很常用。

请始终按照说明书上所列的推荐抗原修复方法。

推荐抗体稀释度:1:500-1:2000

 

识别短肽序列的抗体的实验方案提示

如果您正在使用通过短肽序列而研发的胶原蛋白抗体(例如,ab138492),无需特别小心地保持胶原蛋白的三维结构。我们所有的 RabMAb® 胶原蛋白抗体都是使用合成短肽制成的,对目标胶原蛋白具有序列特异性。这能让您利用常规的蛋白质印迹、ELISA  IHC 实验方案,无需考虑方案调整。更多技巧和实验方案,请在此查看我们的实验方案书,其中包含 ELISAIHC/ICC 和蛋白质印迹的实验方案。 


脊椎动物胶原蛋白分布

胶原蛋白

结构

分布

序列特异性抗体

结构特异性抗体

I

纤维状

广泛

ab138492

ab34710

II

纤维状

软骨、玻璃体

ab188570

ab34712

III

纤维状

皮肤、血管、肠

ab184993

ab7778

IV

网状

基底膜

ab214417

ab6586

V

纤维状

广泛


ab7046

VI

网状

广泛

ab182744

ab6588

VII

锚原纤维

真皮、膀胱

ab223639

ab93350

VIII

网状

广泛

ab58776


IX

FACIT

软骨、角膜、玻璃体



ab134568

X

网状

软骨

ab182563

ab58632

XI

纤维状

软骨、
椎间

ab196613


XV

FACIT

基底膜

ab58717


XVII

MACIT

上皮细胞中的半桥粒

ab184996

ab79878

1.脊椎动物胶原蛋白。1修改自 Shoulders MD, Raines RT.COLLAGEN STRUCTURE AND STABILITY.Annual review of biochemistry.2009;78:929-958. doi:10.1146/annurev.biochem.77.032207.120833.

 

参考文献
1.Shoulders MD, Raines RT.COLLAGEN STRUCTURE AND STABILITY.Annual review of biochemistry.2009;78:929-958. doi:10.1146/annurev.biochem.77.032207.120833.
2.Mocan E.Tagadiuc O.Nacu V. (2011) Aspects of collagen isolation procedure. Clin.Res.Studies 2, 3
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