染色质免疫沉淀 FAQ

裂解液需要多长时间的超声处理才能将 DNA 剪切至合适的大小?

免疫沉淀(IP)之前,需先进行超声处理时程研究,以确定获得理想片段大小的最佳条件。建议的时间进程是 5、10、15 和 20 分钟,碎片大小将随着时间进程的增加而减小。确保样品在整个超声处理过程中保持冰冷状态。在 1.5% 琼脂糖凝胶上加载 10 μL 样品,以分析 DNA 片段大小。


超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用,因此条带大小应不小于 200 bp。


每个 IP 需要多少蛋白质?

每个 IP 使用约 25 µg 蛋白质。可使用 Bradford 测定法计算蛋白质浓度。用 RIPA 缓冲液按照 1 : 10 比例稀释各样品溶液。



每个 IP 需要多少抗体?

需要根据经验确定需要加入的抗体量。首次试验时,可尝试每 25 µg 蛋白质加 3-5 µg 抗体;如果未观察到信号,则可增至 10 µg。

多克隆抗体优于单克隆抗体;因为单克隆抗体只能识别单个表位,而在多克隆抗体群中会包含识别不同表位的许多抗体。多克隆抗体群体可降低所有特定表位被交联过程掩盖的可能性,因此在 X-ChIP 中获得阳性结果的机会更大。



交联的重要性有哪些?

交联是一个以时间为关键因素的程序,应该在 10 分钟内完成。过度交联可导致与 DNA 结合的蛋白质量减少,降低与抗体结合的表位/表位变化的可用性。反过来,这将导致样品中可用的材料结合/抗原减少。



最佳的反向交联温度和孵育时间是多少?

使用 5 M 氯化钠于 65℃ 条件下将交联逆转 4 小时至过夜。很重要的一点是,本步骤需要进行至少 4 小时。

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