使用植物样本的 ChIP：拟南芥属

使用植物样本的 ChIP 的详细程序和技巧。根据 Werner Aufsatz 提供的方案编辑。

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介绍

真核生物染色质是由 DNA 和相关组蛋白组成的复合体，参与 DNA 到染色体的高级包装过程。给定 DNA 序列的染色质状态影响转录活性和复制时间，并受 DNA 和组蛋白的潜在可逆共价修饰的调节。

组蛋白在灵活 N 端末端的保守赖氨酸和精氨酸残基的修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化，指定了一个代码，作为与染色质相关蛋白的特定结构域相互作用的平台。

交联染色质与特定组蛋白修饰（染色质免疫沉淀，ChIP）特异性抗体的免疫沉淀 (IP) 及随后通过 PCR 对 IP 组分内目标 DNA 序列的潜在富集或耗竭进行的检测，构成了简洁而直接的单个基因特定染色质状态查询方法，已在许多实验室中常规化使用。

然而，与动物细胞不同的是，植物细胞具有坚硬的细胞壁，限制了动物实验方案的简单应用。本方案描述的方法用于研究植物模式生物拟南芥中的组蛋白修饰。本方案是 Lawrence 及其同事发表的原始程序的改编版本（Lawrence 等人，2004 年）。

本方案描述了如何从拟南芥中制备随后可用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 的染色质。开始 X-ChIP 检测前，应测定确切的染色质浓度。查看我们的交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP) 方案，该方案应在下面详细介绍的染色质制备完成后使用。

程序

拟南芥种子在 4℃ 0.1% Phytablend w/v 中分层 48 小时，然后播种到土壤上。每次制备染色质使用 1.5 g 3-4 周龄的完整幼苗。采收时要尽量避免土壤污染。

第一天

染色质交联

1. 收获 1.5 g 种苗，置于 50 mL 试管中。
2. 用 40 mL 双蒸水冲洗种苗 2 次。第二次清洗后，尽可能多地清除水分。
3. 加入 37 ml 1% w/v 甲醛溶液。通过用尼龙网填充试管，在试管底部轻轻浸没幼苗。旋紧瓶盖并在瓶盖上戳针孔。放入干燥器中，抽真空 10 分钟。
4. 缓慢释放真空，轻轻摇晃干燥器，除去气泡。幼苗应呈半透明状。
5. 加入 2.5 mL 2 M 甘氨酸淬灭交联。抽真空 5 分钟。
6. 再次缓慢释放真空，轻轻摇晃干燥器，除去气泡。
7. 取出尼龙网，倾去上清液，用 40 mL 双蒸水洗苗 2 次。第二次清洗后，尽可能多地清除水分，把秧苗放在两层厨用纸之间。小心卷起纸层，以尽可能多地去除液体。​
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   在这一步骤中，可以在液氮中速冻，并在 -80℃ 下保存植物材料。
   
   

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染色质制备

1. 用液氮预冷研钵。加入两小勺白色石英砂和植物材料。把植物材料磨成细粉。
2. 用冷却的勺子将粉末添加到 30 mL 冰上保存的提取缓冲液 1 中。涡旋混合并保持在 4℃ 条件下，直至溶液均匀。
3. 4℃ 下，在转轮或同等装置上旋转 30 分钟。
4. 将浸提液过滤至新的、冰冷的 50 mL 锥形管中。按压，以从固体材料中回收浸提液。
5. 重复第四步。
6. 将提取液在 4℃，4000 rpm 离心 20 分钟。
7. 轻轻倾去上清液，用移液器上下吹打，使沉淀重悬于 1 mL 提取缓冲液 2 中。转移溶液至 Eppendorf 管中。
8. 在冷却的台式离心机中以 13000 rpm 转速离心 10 分钟。
9. 移取上清液，通过上下吹打将团块垂悬于 300 µl 提取缓冲液 2 中。
10. 向新鲜 Eppendorf 管中加入 300 µl 提取缓冲液 3。用移液器小心地将第 9 步中的溶液分层到溶液上。
11. 在冷却的台式离心机中以 13000 rpm 转速离心 1 小时。同时，制备 10 mL 细胞核裂解缓冲液和 20 mL ChIP 稀释缓冲液。将缓冲液放入冷藏室。
12. 除去上清液，将团块重悬于 300-500 µl 冷细胞核裂解缓冲液中。通过上下吹打和涡旋重悬。涡旋期间保持溶液冷却。在冰上孵育 20 分钟。
13. 取 10 µl 在琼脂糖凝胶上运行。
14. 用超声仪在 4℃ 下超声处理 10 分钟：设置“高”，10 秒“打开周期”，45秒“关闭周期”。​
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    确保溶液在超声处理期间不会产生泡沫，例如，在超声处理步骤实施期间，使用含 100% w/v 乙醇的冰块冷却试管。

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15. 在冷却的台式离心机中以 13000 rpm 转速离心 10 分钟。向新的 Eppendorf 管中加入上清液。

16. 重复步骤 14。取 10 µl 在琼脂糖凝胶上运行。

17. 在 1.5% w/v 琼脂糖凝胶上将通过步骤 12 和 15 获取的溶液等分。在超声处理过的样本中，与未处理样本相比，DNA 应该发生偏移且强度更大，范围在 200-2000 bp 之间，集中在 500 bp 附近。

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    步骤 16 完成后，可在液氮中“速冻”，并在 -80℃ 条件下存储染色质样本。但应避免反复冻融。

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预清除和免疫沉淀 (IP)

1. 将染色质转移至 15 mL Falcon 管中。用新鲜、冰冷的 ChIP 稀释缓冲液稀释 1/10。
2. 在 Eppendorf 管中用 1 mL ChIP 稀释缓冲液将所需量的磁珠冲洗 3 次，制备预吸收剪切鲑鱼精子 DNA 的蛋白 A 琼脂糖磁珠。两次清洗之间，在冷却的台式离心机中以 13000 rpm 转速离心 30 秒，以沉淀微珠。最后一次清洗后，用 ChIP 稀释缓冲液重悬微珠，得到 25% 浆液（出于移液原因）。
3. 加入 140 μL 洗涤后的微珠，预清除每个染色质样本。在 4℃ 下旋转 1 小时。
4. 在冷却的离心机中以 3000 rpm 转速离心 Falcon 管 3 分钟，沉淀微珠，将上清液转移到新的 Falcon 管中。注意不要携带微珠。
5. 将 60 μL 混合染色质等分试样储存于 -20℃ 条件下。随后将其作为输入对照。
6. 每个 IP 添加 600 μL 染色质溶液至含有适当抗体的 Eppendorf 管中。必须根据经验确定每种所用抗体的最佳染色质/抗体比。根据经验，对于多克隆抗体，每个 IP 使用约 10 μg 抗体。对于单克隆抗体，通常必须使用 1.5x 至 4x 的更高浓度。另外设置 600 μL 不含抗体或含无关抗体的染色质溶液，作为模拟 IP。
7. 向染色质 IPs 中加入 80 μL 洗涤过的蛋白 A 琼脂糖珠（25% 浆液；制备见步骤 2）。4℃ 下旋转过夜。
   
   

第二天

免疫复合物的收集、清洗和洗脱

1. 制备新鲜洗脱缓冲液，置于 65℃ 条件下。
2. 在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 离心 Ips 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
3. 每管加入 1 mL 低盐洗涤缓冲液。在 4℃ 下旋转 5 分钟。
4. 在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 转速离心 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
5. 每管加入 1 mL 高盐洗涤缓冲液。在 4℃ 下旋转 5 分钟。
6. 在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 转速离心 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
7. 每管加入 1 mL LiCl 洗涤缓冲液。在 4℃ 下旋转 5 分钟。
8. 在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 转速离心 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
9. 每管加入 1 mL TE 缓冲液。在 4℃ 下旋转 5 分钟。
10. 在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 转速离心 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
11. 重复 TE 清洗。在冷却的台式离心机中以 5000 rpm 转速离心 30 秒，收集微珠，弃去上清液。
12. 加入 250 μL 洗脱缓冲液，洗脱免疫复合物。短暂涡旋混合，并在 65℃ 下孵育 15 分钟。在台式离心机中以 13000 rpm 转速离心 30 秒，并将上清液转移至新鲜的 Eppendorf 管中。
13. 重复洗脱，最后合并两次洗脱物。

反向交联

1. 在样本中加入 20 μL 5M 氯化钠。在 65℃ 条件下孵育过夜。
2. 第 1 天，在 60 μL 输入对照等分试样中加入 109 μL TE 缓冲液、7.1 μL 5M NaCl 和 8.7 μL 20% SDS。在 65℃ 条件下孵育过夜。
   
   

第三天

DNA 清除

1. 在 IP 样本中加入 10 μL 0.5 M EDTA、20 μL 1 M Tris-HCl pH 6.5 和 1 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K。在输入对照样本中加入 1.2 μL 0.5 M EDTA、2.4 μL 1 M Tris-HCl pH 6.5 和 1 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K。在 45℃ 条件下温育 1-3 小时。孵育过程中可轻轻振摇样本。
2. 使用硅胶膜（如 PCR 纯化试剂盒）纯化 DNA。用 50 μL 10 mM Tris-HCl pH 8.0 洗脱两次 DNA，合并洗脱物。接下来进行 PCR 反应。Haring 等人为通过实时 PCR 定量 ChIP 提供了很好的指南 (2007)。
   
   

材料和试剂

提取缓冲液 1

0.4 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM 氯化镁

5 mM β-巯基乙醇

蛋白酶抑制剂

提取缓冲液 2

0.25 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM 氯化镁

1% w/v Triton X-100

5 mM β-巯基乙醇

蛋白酶抑制剂

提取缓冲液 3

1.7 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl, pH 8.0

2 mM 氯化镁

0.15% w/v Triton X-100

5 mM β-巯基乙醇

蛋白酶抑制剂

细胞核裂解缓冲液

50 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

1% w/v SDS

蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂

1 mM PMSF（最终浓度）

蛋白酶抑制剂套装（遵照生产商说明）

CHIP 稀释缓冲液

1.1% Triton X-100

1.2 mM EDTA

16.7 mM Tris-HCl, pH 8.0

167 mM 氯化钠

洗脱缓冲液

1% SDS

0.1 M NaHCO3

低盐清洗缓冲液

150 mM 氯化钠

0.1% SDS

1% Triton X-100

2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

20 mM Tris-HCl, pH 8.0

高盐清洗缓冲液

500 mM 氯化钠

0.1% SDS

1% Triton X-100

2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

20 mM Tris-HCl, pH 8.0

LiCl 清洗缓冲液

0.25 M 氯化锂

1% 乙基苯基聚乙二醇

1% 脱氧胆酸钠

1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

10 mM Tris-HCl, pH 8.0

TE 缓冲液

10 mM Tris-HCl, pH 8.0

1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

参考文献： 

• 
  
• Haring M,Offermann S, Danker T, Horst I, Peterhansel C and Stam M (2007). Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods, 3: 11.
• Lawrence RJ, Earley K, Pontes O, Silva M, Chen ZJ, Neves N, Viegas W and Pikaard CS (2004). A concerted DNA methylation/histone methylation switch regulates rRNA gene dosage control and nucleolar dominance. Mol Cell, 13: 599-609.
• Lippman Z, Gendrel AV, Black M, Vaughn MW, Dedhia N, McCombie WR, Lavine K, Mittal V, May B, Kasschau KD, Carrington JC, Doerge RW, Colot V and Martienssen R (2004). Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature, 430: 471-476.
• Xie Z, Johansen LK, Gustafson AM, Kasschau KD, Lellis AD, Zilberman D, Jacobsen SE and Carrington JC (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol., 2: 642-652.