ChIP 优化
Related
与蛋白 A 或 G 微珠的非特异性结合
包含预清除步骤；该步骤要求将裂解样本与微珠单独混合 1 小时，并在加入抗体前取出。
ChIP 缓冲液可能被污染
制备新鲜裂解液和洗涤液。
一些蛋白 A 或 G 微珠提供高背景
寻找可以在非特异性对照品中提供最清洁的低背景结果的合适供应商。
更多 ChIP 资源和产品
阅读这些 ChIP 疑难解析提示后，查看更多 ChIP 检测/染色质免疫沉淀资源和产品，或者直接获得重要的 ChIP 数据：
- 经过仔细验证的 ChIP 抗体，包括重组兔单克隆抗体，旨在年复一年地提供完全相同的性能
- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质
- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500，或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。
较大区域内具有低分辨率和高背景
DNA 片段大小可能过大
使用不同细胞类型时，应优化 DNA 片段化。超声处理时间和酶孵育时间可能不同。我们建议 DNA 片段大小不超过 1.5 kbp。如果使用酶消化染色质，可获得单核小体 (175 bp)。
低信号
染色质尺寸可能太小
不要将染色质超声处理成小于 500 bp 的片段。随着核小体内 DNA 被消化，超声处理到较小的尺寸可以置换核小体。进行 N-ChIP 酶消化一般足以使染色质破碎。
如果进行 X-ChIP，细胞交联时间可能过长
与甲醛交联 10-15 分钟，用 PBS 冲洗。可能需要用甘氨酸处理细胞，以淬灭甲醛。过度交联可降低表位的可用性，从而降低抗体结合。
起始原料不足
我们建议每次免疫沉淀使用 25 μg 染色质。
免疫沉淀中抗体不足
我们建议首先使用 3-5 μg 抗体。如果未观察到信号，则可增加至 10 μg。
特异性抗体结合被消除
洗涤缓冲液中不得使用高于 500 mM 的氯化钠，因为这可能过于严格，会去除特异性抗体结合。
细胞未有效裂解
我们建议使用 RIPA 缓冲液裂解细胞。其组成可以在我们的 X- ChIP 方案中找到。
目标区域无抗体富集
在目标区域没有发现抗原表位。确保包含阳性对照抗体，以确认在活性/非活性启动子（例如 H3K4me3/H3K9me3 抗体）上实施的程序进展正常。
N-ChIP 不适用
分析 DNA 亲和力较弱或距离 DNA 较远的蛋白质时，X-ChIP 可能更适合。终止蛋白质与 DNA 解离可能需要交联。组蛋白排列紧密，因此在研究组蛋白时可以进行 N-ChIP。
单克隆抗体可能不适用于 X-ChIP
抗原表位在交联过程中可能被掩盖，从而阻止抗原表位识别。我们建议使用可识别多个表位的多克隆抗体，因为免疫沉淀目的蛋白的机会增加。
使用了错误的抗体亲和微珠
蛋白 A 和 G 是以不同亲和力结合各类免疫球蛋白的细菌蛋白。使用将结合您目的抗体的亲和基质。我们建议使用与琼脂糖偶联的蛋白 A 和蛋白 G 的混合物。
免疫沉淀 DNA 的 PCR 扩增问题
PCR 完成后，所有样本中出现高信号，包括无模板对照
实时 PCR 溶液可能被污染，我们建议从储备液中制备新溶液。
样本中无 DNA 扩增
务必包含标准/输入 DNA，以确认引物正常工作。