染色质免疫沉淀 (ChIP) 提示和技巧

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- 经过仔细验证的 ChIP 抗体，包括重组兔单克隆抗体，旨在年复一年地提供完全相同的性能

- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质

- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500，或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。

什么是 ChIP？

ChIP 的原理很简单：选择性富集含有特定蛋白质的染色质组分。抗体用于免疫沉淀目标蛋白及其相关 DNA。接下来通过 PCR、微阵列或测序等进行回收与分析，找出蛋白质结合的基因组位点。

ChIP 最常研究的染色质类型是常染色质。常染色质含有活性基因，并保持开放、疏松的结构，以便在转录、DNA 修复和基因复制中发挥重要作用。

异染色质含有许多失活的基因，很难通过 ChIP 进行分析，主要原因在于其凝聚态和重复的 DNA 序列。

ChIP 为何是一项非常有用的技术？

ChIP 分析染色质及其相关因子之间相互作用的时空动态。

该技术使我们能够绘制单个启动子每分钟的变化，或者在整个人类基因组中跟踪单个转录因子。必须记住的是，输出是分析细胞群产生的平均值。

ChIP 是多功能的，可以让我们深入了解基因在其自然背景下如何被调控。

ChIP 是如何工作的？

ChIP 用于确定一个给定的蛋白质在体内是否与特定的 DNA 序列进行了结合。

ChIP 程序包括以下步骤：

1. 总染色质的分离
2. 染色质的断裂（以实现分离）
3. 所得染色质片段的免疫沉淀
4. 分析免疫沉淀组分，以确定靶 DNA 序列相对于其在输入染色质中丰度的量。

ChIP 是一种听起来有些令人生畏的技术，但只要拥有合适的工具，就可以掌握这一技术。如果您的实验室在 ChIP 技术方面还不成熟，您可以考虑使用一种试剂盒，例如 ChIP 试剂盒 ab500。

ChIP 实验成功的有用技巧

交联

交联 DNA 和蛋白质通常需要在分析前稳定其相互作用。ChIP 可以通过两种不同的方式进行，取决于您是否选择交联您的染色质样本。

如果您交联您的样本，那么该技术被称为交联 ChIP（X- ChIP），否则将被称为自然 ChIP（N-ChIP）。

选择交联还是不交联？

交联的目的是将目的抗原固定在其染色质结合位点上。组蛋白本身一般不需要交联，因为它们已经与 DNA 紧密相连。 

其他对 DNA 或组蛋白亲和力较弱的 DNA 结合蛋白可能需要交联。交联可以让它们保持在适当的位置，并避免蛋白质从染色质结合位点解离。

距离您的目标相互作用 DNA 越远，无交联的 ChIP 效率就越低。

 用于组蛋白修饰的 ChIP 不太可能需要交联，但 DNA 结合复合物中包含的转录因子和蛋白质等非组蛋白可能需要交联。

如何交联？使用甲醛，因为它形成的连接是可逆的。详见我们的 N-ChIP 和 X-ChIP 方案。UV 交联不合适，因为它是不可逆的。应该指出的是，甲醛的替代交联剂确实存在 — 如果研究人员需要在各种分子间距离上交联，这些替代交联剂可能有用。

甲醛是一种非常好的 DNA-蛋白质交联剂，但由于尺寸小（2 Å），它并不是一种非常有效的蛋白质-蛋白质交联剂。因此，通常很难对不直接与 DNA 结合的蛋白质进行 ChIP 分析。

可以过度交联吗？

可以。交联是一个对时间要求严格的过程。交联通常只能进行几分钟。过度交联会导致多个问题，包括抗原可用性和超声效率降低。例如，抗原决定簇可能被掩盖或改变，影响抗体结合抗原的能力，进而导致您的样本中的材料减少。

始终执行时间进程实验，以优化交联条件。我们建议将样本交联 2-30 分钟。加入甘氨酸淬灭甲醛，终止交联反应。

为了进一步帮助 DNA 纯化，可通过蛋白酶 K 处理来破坏蛋白质和 DNA 之间的交联，蛋白酶 K 会裂解邻近脂肪族和芳香族氨基酸羧基的肽键。

染色质断裂

为了使抗体试剂易于进行相互作用，需要使染色质碎裂。为破碎染色质，您既可以超声处理染色质，也可以用微球菌核酸酶消化染色质。您选择的方法在很大程度上取决于所进行的 ChIP 实验的类型。

无论您使用什么方法，每次设置实验时，一定要运行片段化时间过程。

含酶消化的 N-ChIP

用微球菌核酸酶进行酶消化足以破碎您的样本，以进行 N-ChIP。N-ChIP 不需要交联，因此不会对酶进入其靶标产生潜在影响。

使用酶技术可以产生单个单体（约 175 个碱基对），在标准 ChIP 中提供最高的分辨率。然而，某些染色质结合剂，如转录因子，通常结合核小体间 DNA，因此纯化的单核小体不适合。

另外，核小体是动态的，没有交联，它们可能在酶消化过程中重排。如果想要绘制基因组区域图，这是一个潜在的问题，必须使用合适的对照品来监测任何变化（定量 PCR 见检测对照品）。

酶切不会产生染色质的随机切片。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有利，但对 DNA 的消化不均匀或不相同。结果可能不完全准确，因为某些位点可能被过度表达，而且一些数据可能会被遗漏。

如何在消化中获得一致性？

您购买原液酶后一定要等量分装，每次做实验时都要用新鲜的分装液运行一个新的时间过程。尽管在储存过程中酶的质量可能会随着时间的推移而发生变化，但相对而言，染色质制备期间的变异风险（压实度等）要高得多；一个染色质样本不应视为与之前的所有其他样本相同。

做 N-ChIP 时，应进行 X-ChIP，作为对照实验，以评估由于没有交联而导致的任何动态和不必要的变化。

X-ChIP 和超声

通常情况下，进行 X-ChIP 时有必要作超声处理，因为甲醛交联限制了诸如微球菌核酸酶等酶对其靶标的访问，这意味着酶消化在交联样本方面通常无效。

通常认为超声处理会产生随机大小的 DNA 片段，没有优先切割的基因组片段，但实际上很少观察到这种情况。超声处理产生的片段平均为 500-700 个碱基对（2-3 个核小体），通常比通过酶切产生的片段大。产生的片段大小直接影响 ChIP 程序的分辨率；大多数情况下，在 ChIP 中，能够很好地分辨高达 1.5 kb 的片段。

尽管超声处理最适合 X-ChIP，酶消化对完全交联的样本无效，但需要温和或不完全交联时，微球菌核酸酶消化是有用的，它可以结合超声处理，提高分辨率。

避免起泡，因为起泡会导致溶液内的能量转移减少，并降低超声效率。

超声处理的染色质可在液氮中速冻，并在 -80℃ 条件下保存长达 2 个月。避免多次冻融。

用于 ChIP 的抗体

在 ChIP 中，抗体用于捕获蛋白质和相互作用的 DNA，理想情况下应充分表征。确保抗体在 ChIP 中工作。如果可用，使用已充分表征并标记为 ChIP 级的抗体。

对于 N-ChIP，推荐使用蛋白质印迹中的肽竞争来表征抗体特异性。理想情况下，ChIP 的特异性抗体应该经过亲和纯化；然而，许多实验室将血清作为其抗体来源，然后克服严谨型缓冲液可能出现的背景问题。

即使充分表征，也无法说明一个抗体是否会在 X-ChIP 中发挥作用，因为交联的影响可以达到戏剧性的程度，以至产生不同的表位，特定表位可能会丢失。如需检测一个未表征的抗体是否可以进行 ChIP，可以先用抗体进行 ChIP，然后用同样的抗体进行 western blot。

没有 ChIP 级抗体？

​如果没有可用的抗体，那么在 IP 和 IHC 中工作的抗体就是合适的候选者。对于 N-ChIP，推荐使用蛋白质印迹中的肽竞争来表征抗体特异性。理想情况下，ChIP 的特异性抗体应该经过亲和纯化；然而，许多实验室将血清用作其抗体来源，再克服严格缓冲液可能出现的背景问题（参见其他常见问题）。用于组蛋白修饰的抗体需要彻底检测特异性，例如通过肽阵列检测。

多克隆抗体与单克隆抗体

单克隆抗体只能识别一个表位，而在多克隆抗体群中，会有许多识别不同表位的抗体。多克隆群体可降低所有特定表位被交联过程掩盖的可能性，因此在 X-ChIP 中出现阳性结果的机会更大。但是，单克隆抗体的批间一致性通常较高。

我可以使用什么抗体对照品？

作为该技术的阳性抗体对照，组蛋白 H3 三甲基 K4 (H3K4me3) 和三甲基 K9 (H3K9me3) 分别是研究活性基因和非活性基因时常用的阳性对照。

请记住，这些抗体本身并不是阳性和阴性对照，因为对照取决于您正在研究的位点：如果在特定的目标位点没有 H3K4me3，那么全球最好的抗 H3K4me3 ChIP 级抗体将不会免疫沉淀来自该区域的任何东西，因此不是一个合适的阳性对照。

作为阴性对照，使用识别非染色质表位的抗 体，如抗 GFP 抗体。

染色质重塑可能移动或移除特定位点的组蛋白，例如活性启动子，因此使用针对非修饰组蛋白（如组蛋白 H3）的对照抗体来检查特定基因组位点的核小体的保存。

分析组蛋白修饰时，需要标准化到组蛋白内容物。这一操作可以用抗 H3 抗体 (ab1791) 完成。

抗体对 ChIP 起作用，但信号较弱 — 我如何补救？

第一步，您可以尝试不同类型的 ChIP。例如，如果您正在执行 N-ChIP，那么尝试 X-ChIP。或者，在不同的位置查看。可能存在抗原，但不在您正在观察的基因组位点上。如果可以的话，最好尝试不同的抗体，以找到在 ChIP 中效果最好的抗体。最后，目标表位可能在 X-ChIP 中被掩盖了：可能有必要进一步优化交联时间进程。

我的 ChIP 实验应该用什么浓度的抗体？

首次试验时，每使用 25-35 mg 纯单体，可使用 3-5 µg 抗体。如果您正在做定量 ChIP，那么最终您可能需要将一定量的染色质与等量的抗体进行匹配。与许多技术一样，如有可能，有必要在开始时优化抗体量。

即使抗体能够将目的蛋白免疫沉淀在甲醛固定的染色质中，也并不意味着 ChIP 实验已经奏效，因为有可能您的目的蛋白没有与 DNA 交联。

如果观察到高背景，可能需要额外清洗。另外，在免疫沉淀前，还可以用蛋白 A/G 微珠孵育 1 小时，从而预清除超声处理的染色质。在该附加步骤中去除与微珠的任何非特异性结合。

检测

定量 PCR 用对照品

基因组的某些区域会比其他区域纯化得更好，一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此，在起始物料以及纯化/碎裂物料的几个区域生成 PCR 引物，作为虚假结果的对照，至关重要。裂解起始细胞，制备起始物料，并取样用于与 ChIP 平行的控制区简单 PCR。

数据

​在起始物料可能发生变化的情况下，应始终对起始物料的量进行数据标准化，以消除由于样本量不均匀而引入的误差。为了规范化您的数据，取最后的扩增子值并将其除以输入物料的扩增子值。对于组蛋白修饰，免疫沉淀的物料通常被标准化为相关的免疫沉淀组蛋白的输入量和数量。例如，带有 H3K4me3 抗体的 ChIP 将相对于输入量和 H3 免疫沉淀量表达。

测量起始物料的数量（和质量）是有效解释结果的关键。

其他常见问题​

ChIP 应该使用什么组蛋白对照样本？小牛胸腺组蛋白制剂应作为阳性对照组蛋白样本，用于 western blot 中抗体特异性的检查。免疫沉淀组蛋白修饰时，纯化的组蛋白 H3 和 H1 可以作为实验组蛋白制备质量的阳性对照（组蛋白 H1 通常用于 X-ChIP）。

推荐使用何种缓冲液？

​使用的缓冲液越严格，结果越好（即缓冲液中盐和清洁剂的浓度越高，结果越干净）。必须为每一个新的 ChIP 实验优化缓冲液，因为必须在低背景和对目标的有害影响之间找到折中方法。NP-40 可作为去污剂，RIPA 也常用于 X-ChIP。

还有哪些处理可能会影响我的 ChIP 结果？

添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 ChIP。

请勿在高 rpm（不超过 6,000 rpm）下离心琼脂糖凝胶微珠，否则会压缩微珠并损坏微珠。

一些抗体会受到浓度相对较低的 SDS 的影响。

优势和缺点

摘自 O’Neill 和 Turner，方法，2003 年，第 76-82 页

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