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1. 溶液配置
1.1 2xSDS 上样缓冲液:125mM Tris-Hcl (pH6.8),2.5% SDS,0.04% Bromophenol Blue,25% Glycerol,0.1M DTT,ddH2O
1.2 10x 电泳缓冲液:将 151.425g Tris,720.67g Glycine 和 50g SDS 充分溶 解于 3.5L 去离子水中, 然后定容至 5L。室温保存备用。
1.3 1x 电泳缓冲液:将 10x 电泳缓冲液用去离子水 10 倍稀释,于 4℃预冷。
1.4 10x 电转缓冲液:将 151.425g Tris,720.67g Glycine 和 5g SDS 充分溶 解于 3.5L 去离子水中,然后定容至 5L。室温保存备用。
1.5 1x 电转缓冲液:使用前向 500ml 10x 电泳缓冲液中加入 500ml 甲醇,然 后用去离子水定容至 5L。于 4℃预冷。
2.1 胶的制备
按下表所示组分制备 4-20% 梯度胶。
2.2 上样
将裂解液于冰上融解,加入等体积 2xSDS 上样缓冲液,95-100℃煮沸 5min 后上样,上样量一般为 20ug/孔。
2.3 电泳
向电泳槽中加入预冷 1x 电泳缓冲液, 150 伏电压 4℃下电泳 1h。
2.4 转膜前准备
将电泳后的胶于预冷1x电转缓冲液中平衡10min。PVDF膜(孔径0.45um)、 转膜用滤纸及海绵在预冷 1x 电转缓冲液中浸泡 30min。
注:PVDF 膜在浸泡前需用 99.5%的甲醇或无水乙醇活化 15s,去离子水洗 涤 3 次。
2.5 转膜(湿法)
设置电转仪电压至 75 伏,加入预冷 1x 电转缓冲液, 4℃转膜 1h。
2.6 丽春红染色
用去离子水冲洗膜,将膜置于摇床上,洗涤 5min 后用丽春红染色 5min, 最后用去离子水洗涤 3 次。
2.7 储存
用无水乙醇处理膜,待膜干燥后备用。如长期保存,需放置于 4oC。