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细菌表达与哺乳动物表达之间的差异。
重组蛋白广泛用于生物学和生物医学研究。每位使用外购蛋白的研究人员都清楚获得纯净、高质量、无杂质、高批间一致性产品的重要性 —— 这些属性是获得可靠、可重复性结果的关键。但是,评估制造商的蛋白品质时,我们常常忽略它们使用的表达系统。
市售蛋白成功地将多种生物体用做了生物界的表达系统:细菌、植物、真菌、昆虫或哺乳动物细胞系,包括人。
如果您对细菌研究感兴趣,显然您需要购买用细菌生产的蛋白。但是,请注意您是否正在进行人类研究 —— 许多市售人源蛋白是在细菌系统中生产的,也就是说,它们不会被正确折叠或修饰,因此不会像天然同等蛋白一样运作,并且不稳定。这样会导致研究结果不适用于真实的临床环境。
“哺乳动物表达系统拥有一套细胞机制,可以确保市售蛋白中的 PTM(翻译后修饰)与人体内表达的相同蛋白的细胞机制完全相同 —— 但原核系统根本没有这套机制。正确的 PTM 还有助于蛋白正确折叠,”Abcam 英国剑桥生物医学园区及 Abcam 中国杭州研究机构蛋白科学负责人 Gráinne Dunlevy 博士表示,“如果您的实验需要使用与天然蛋白完全相同的功能性人源蛋白,很可能细菌表达的同等蛋白也不起作用,您必须添加更多蛋白。”
简单来说,机体内,编码一个基因的细胞核 DNA 转录成 mRNA,mRNA 再翻译成多肽并折叠进蛋白的 3D 结构,这一过程是在固有氨基酸性能和天然环境诱导的 PTM 的共同作用下完成的。由此生成的功能性蛋白被分泌或运转到它们的最终目的地。1
而在实验室,编码靶蛋白的 DNA 结构通过克隆载体转染进入生物表达系统,由此生成的蛋白被分泌到培养基中。随后,用亲和柱捕获、纯化并分析蛋白的纯度和功能。2,3虽然整个生物界的转录和翻译相似,但蛋白的折叠和 PTM 不同,而且主要取决于表达物种的天然环境和细胞解剖。
哺乳动物细胞中,折叠发生在内质网中,而细菌细胞没有这种结构,这种结构包含能促进正确折叠、二硫键形成和 N-连接糖基化的酶和氧化环境。4之后,既定分泌蛋白进入可能发生 O-连接糖基化的高尔基体(只存在于真核生物中)(图 1)。4
折叠错误且缺少天然 PTM 的蛋白无法发挥功能甚至不稳定,这就是大量市售复杂蛋白使用哺乳动物系统表达最好的原因。2
虽然上文讨论了正确折叠和 PTM 问题,许多蛋白制造商仍使用细菌生产人源蛋白。当然,与哺乳动物系统相比,使用原核系统生产蛋白产量更高,也更容易。
“这取决于您希望您的蛋白发挥什么作用,”Dunlevy 博士指出,“在生化检测例如 western blot中,您只想检测蛋白是否存在以及蛋白数量,因此可以使用在非哺乳动物系统中表达的蛋白。但是,对于细胞检测 —— 例如那些评估活性、增殖、细胞毒性或细胞死亡的检测 —— 功能性生物活性很重要,必须使用与人类天然蛋白相同的蛋白。也就是说,在哺乳动物系统中表达。”
与用哺乳动物细胞系生成的蛋白相比,用原核系统生成的人源蛋白更不稳定 —— 天然糖基化有助于蛋白正确地连接。用原核系统生产且部分折叠的人源蛋白不稳定,容易降解,而且“很黏” —— 比如它们会聚集在一起形成聚集体。这会为实验带来变数,减少它们的有效保质期。
因此,临床上用于患者或药物验证中用于支持临床使用的重组蛋白一直由制药公司在哺乳动物表达系统中生产,旨在确保它们与机体产生的天然蛋白完全相同且功能相同。我们已经发现,实验室会根据使用目的为原核蛋白准备一块地方,但通常 —— 您的研究越接近临床使用,使用正确折叠和修饰的蛋白,例如与天然蛋白完全相同的蛋白,越重要。这样有利于实验室到临床的顺利过渡。
但是,从实验开始就使用与天然蛋白完全相同的产品可以让研发项目的早期研究人员获益。中途更换产品需要大量时间和精力验证结果和重复实验。与哺乳动物蛋白相比,用原核系统生产的蛋白每克的价格更便宜 —— 但从研究项目的整个周期来看,考虑到因可能缺失功能和最终必须转换成与天然蛋白完全相同的产品所产生的费用,选用后者的费用则会高于预期。此外,由于稳定性(保质期)高于细菌型同等蛋白,哺乳动物蛋白成为各研究阶段颇具吸引力的选择 —— 取用少量即能进行大量实验。
Dunlevy 博士在制药和生物制药公司内部从事蛋白研发工作已有 16 年有余。“我们的科学家会请我研发真正能用于他们的活性检测、品质够高且折叠正确的蛋白 —— 因为他们在市面上买不到这种蛋白,”她说,“我们再一次看到,市售蛋白市场与高品质蛋白之间的真正差距,但缺乏大型制药公司资源的研究人员只能使用他们能买到的蛋白做实验。这种经历驱使 Abcam 研发出适合生物活性检测的优质人类蛋白。”
因此,我们的特优级生物活性蛋白诞生了,这是一个只在哺乳动物系统表达的小蛋白系列,可以满足研究人员对功能性、与天然蛋白完全相同、具备最佳生物活性且能发挥适当生物作用的人类蛋白的需求。
目前,我们的特优级生物活性蛋白系列由 29 种分泌性人类细胞因子组成,我们计划在未来开发更多类型的人类蛋白。
内容来自:Susie Chapman 博士
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1. Ribosomes, Transcription, and Translation. Essential of Cell Biology. https://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/122996756/. Accessed July 29, 2020.
2. Dalton, A.C., Barton, W.A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23, 517–525 (2014). https://doi.org/10.1002/pro.2439
3. Gräslund, S., Nordlund, P., Weigelt, J. et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135–146 (2008). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202
4. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833, 2430–2437 (2013). https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.04.001