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检查细胞培养液的时间到了。您的心一沉:许多细胞看上去已经死了。会不会与新供应商最新批次的细胞因子 IL-6 的刺激有关?是不是样本中的内毒素太多了?是不是稳定性有问题,蛋白质降解了?或者是受到了其他杂质的影响?不管怎么说,几天的时间浪费了,接下来一周都将用在批次验证上 —— 或者是寻找新的蛋白资源上 —— 而不是解决您的研究问题。
Abcam 蛋白科学负责人 Gráinne Dunlevy 博士感同身受,因为她也遇到过同样的问题。作为一名拥有 16 年以上经验的蛋白科学家,她在制药公司工作过很多年,为无法从蛋白质制造市场获取理想高品质蛋白的实验室研究人员提供过蛋白。
“我们的科学家总是对我说,他们买不到零杂质、内毒素含量够低、稳定、折叠正确且所有 PTM(翻译后修饰)均正确的蛋白进行检测、筛选或免疫”她回忆道,“通常,他们会用遍他们能找到的所有市售蛋白,才能开始实验 —— 如果产品效果不佳,他们不得不使用我的蛋白重做实验。这耗费了他们大量的时间。人们能接受不达标的蛋白,我很沮丧。”
现在,Dunlevy 博士的目标不仅仅是帮助她在制药公司的老同事,而且还有那些无法从实验室蛋白表达部门受益的研究人员。
她与 Bernd Gerhartz 博士 —— 剑桥 Abcam 技术开发副总裁共同决定推出市场领先的优质市售蛋白系列 —— 保证与人类天然蛋白完全相同,无杂质,且批间一致性高。我们的特优级生物活性蛋白由此诞生,并且作为人类小蛋白产品目录,仍在不断扩充。
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“我们希望这个系列的蛋白与人类天然蛋白完全相同,也就是说无标签、折叠和 PTM 正确,可以保证最佳生物活性和稳定性。”Dunlevy 博士解释道,“它们必须是不含杂质的 —— 不使用动物成分、无载体且内毒素水平超低。最后,我们会检查每批蛋白的一致性、纯度和活性,确保它们与之前的批次相同,否则我们不会放行。”
特优级生物活性蛋白只在哺乳动物表达系统中生产,由于优化难度较大且产量较低,这种蛋白在市售蛋白制造业非常罕见。克服这些挑战的回报也很高 —— 与原核生成的同等蛋白不同,用哺乳动物系统生成的人源蛋白与人类天然蛋白的折叠和修饰相同。细菌细胞只是缺少正确修饰或折叠它们表达的人源蛋白的细胞机制。因此,只有哺乳动物系统能产生和人类天然蛋白完全相同的蛋白,这些蛋白还比它们的细菌型同等蛋白更稳定(因为它们的结构正确)。
哺乳动物表达还解释了内毒素水平超低 —— 保证 <0.005 EU / µg 的原因 —— 因为系统内没有细菌污染样本。
交给顾客时,这些蛋白“无标签”。这一点是通过在 DNA 结构上引入蛋白酶位点实现的:表达蛋白使用标签进行纯化,随后通过酶切法去除标签,最后再次纯化样本。“第二个纯化步骤增加了时间,且每个步骤都会损耗蛋白;但是,我们致力于提供高品质的产品,因此仍然会执行这类额外的步骤,”Dunlevy 博士说道。
一旦生产出蛋白,我们会用质谱法识别蛋白,再用反相 HPLC 法检查它的纯度(保证纯度达 95%)—— 这样可以标记错误的 PTM、折叠或者因游离蛋白酶引起的意外裂解。这些措施远远超过了通常只依赖 SDS-PAGE 进行识别的蛋白制造标准。
“质谱法和 HPLC 法是大型制药公司检查实验室蛋白的标准,但很少用于市售蛋白生产,”Dunlevy 博士表示,“但是,目测 SDS-PAGE 凝胶上的条带无法准确判断蛋白纯度。而且蛋白脱色太多也会让你认为它的纯度比实际纯度更高。您无法在 PAGE 凝胶上准确测定蛋白的分子量,因此无法辨别该蛋白是否被截短。我们使用反相 HPLC 法定量分析我们的蛋白,这样比吸光度读数更准确。”
“这取决于您希望您的蛋白发挥什么作用,”Dunlevy 博士指出,“在生化检测例如 western blot中,您只想检测蛋白是否存在以及蛋白数量,因此使用大体(但不完全)相同的蛋白可能就够了。但是,对于细胞检测 —— 例如那些测试活性、增殖、细胞毒性或细胞死亡的检测 —— 功能性生物活性很重要,必须使用与人源天然蛋白相同的蛋白。”
最佳功能活性意味着什么?与人体内观察到的活性相同。与天然蛋白相同的蛋白配体可以最快的速度与其天然受体实现最稳定的结合,酶促反应也能尽快完成。
由于特优级生物活性系列的目的在于准确复制人类天然蛋白,因此,必须去除标签。“举个例子,假如您希望使用市售蛋白培养抗体,那么您不能使用带标签的蛋白,因为抗体可能会识别标签上的表位,而非目标蛋白上的表位,”Dunlevy 博士解释道。
性价比高
这种优质方法的性价比也可以很高 —— 使用哺乳动物表达系统生产的蛋白稳定性高,也就是说,比用细菌生产的蛋白好储存,降解或凝聚的可能性低,因此,少量蛋白即能进行大量实验。
此外,如果您的研究目标是临床使用 —— 也就是必须使用与天然蛋白完全相同的蛋白 —— 那么,从研发项目开始就使用相同的蛋白可以节省您的时间和经费。您可以省略更换产品必需的验证步骤,降低太晚发现因使用非天然蛋白造成早期结果失实的风险。
同样地,批间一致性高且证据充分,意味着您可以节省大量时间 —— 您无需在实验室检验每个批次或者因蛋白差异遭遇实验失败,您可以有更多时间专注于您的研究主题。
Abcam 为常规研究市场提供优质抗体的历史悠久,Dunlevy 博士认为,接下去的举措是制造高规格蛋白,例如细胞因子。
“要想生产我们的抗体,我们需要与人类抗体生成抗原完全相同的抗原,”她谈到,“我们无法找到、购买这些抗原,因此我们必须自己研发。换言之,我们多年来在高质量蛋白研发方面积累了专业知识,我们认为,这将有助于我们向需要的人提供相关资源。”
目前,我们的特优级生物活性系列共有 29 种蛋白,由生长因子和细胞因子组成,接下来几个月,我们计划增加更多蛋白类型。
内容来自:Susie Chapman 博士
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