山羊抗鸡IgY H&L (HRP) (ab97135)

Hello! The reply from the lab is below, please let me know if you have any further questions!



Two responses: The first is that the client should NOT use PVDF or any other nylon-based membranes. Chicken antibodies bind non-specifically to PVDF. Instead, they should use nitrocellulose membranes. Many folks aren't aware of this issue.



The second response is that there should be not cross-reactivity to anything in Saccharomyces or any other type of yeast. There are no yeast gene products that I am aware of that are similar to GFP. With that said, the yeast cell wall is tricky, and some things bind to it non-specifically (i.e., via ionic bonds with low affinity). Theoretically, these non-specific interactions can be abrogated with high salt. So, if the client is having trouble with higher-than-normal backgrounds (using nitrocellulose), then they should try making the total salt concentration 1.0 M in the primary antibody preparation.

Vielen Dank für Ihre Antwort.


Es tut mir leid, dass Sie Probleme mit diesem Antikörper hatten. Wie besprochen, habe ich eine kostenlose Ersatzlieferung des ab97135 für Sie in Auftrag gegeben. Sie hat die Referenznummer 1212315 und sollte am 30/11/12 bei Ihnen ankommen.

Ich wünsche Ihnen viel Erfolg für Ihr Projekt. Bitte zögern Sie nicht, sich wieder bei uns zu melden wenn Sie weiterhin Probleme bei der Detektion haben und ich werde wie besprochen ein Austauschprodukt für den primären Antikörper veranlassen.

Vielen dank für Ihre Antwort.

In diesem Fall würde ich Ihnen gerne anbieten nach dem Ausschlussverfahren vorzugehen, wenn Sie damit einverstanden sind.

Ich würde Ihnen gerne ein kostenloses Ersatzprodukt für den sekundären Antikörper zusenden. Wenn Sie diesen für das Experiment verwenden und sie weiterhin kein positives Ergebnis erhalten würde ich im Anschluss gerne den primären Antikörper austauschen.

Es wäre hilfreich, wenn Sie in das nächste Experiment auch eine Kontrolle für das verwendete Kit mit einschließen könnten, um dieses auf die korrekte Funktionsweise hin zu überprüfen.

Bitte lassen Sie mich wissen was Sie von diesem Vorschlag halten. Sobald ich Ihre Rückmeldung erhalte werde ich die kostenlose Lieferung des Ersatzproduktes für den sekundären Antikörper gerne in Auftrag geben.

Vielen Dank für die Email und die Zusendung des ausgefüllten Fragebogens. Anja ist leider außer Haus. Wenn es Ihnen recht ist würde ich mich gerne in dieser Zeit um Ihren Fall kümmern.

Es tut mir Leid, dass sie Probleme mit unseren Produkten haben. Ich möchte Ihnen noch einmal versichern, dass der ab9361 garantiert ist für die ICH-Fr in Maus und damit unter unsere 6 Monatige Garantie fällt, wenn er nicht funktioniert wie auf dem Datenblatt beschrieben.

Leider gibt es nicht viele Veränderungen die ich zu Ihrem Protokoll vorschlagen kann. Um Ihnen zu helfen mehr Informationen zu erhalten und um zu Überprüfung, welcher der beiden Antikörper nicht funktioniert, moechte ich folgende Vorschläge machen.

1. Es wäre wichtig den zweiten Antikörper mit einem anderen primären Antikörper in einem Versuch zu verwenden, um dessen Funktionalität zu bestätigen.

2. Könnten Sie mir bitte genauerer Angaben über die verwendete positiv Kontrolle machen? Welches Gewebe wurde genau getestet?

3. Könnten Sie mir bitte genauere Angaben über das TSA Kit zukommen lassen. Die Herstellerangaben und eine Produktnummer wären hilfreich, so dass ich mir das Kit genauer anschauen kann.

4. Das von uns empfohlene Protokoll für die Färbung lautet wie folgt:

Day 1

1. (If using an HRP conjugate for detection, blocking of endogenous peroxidase can be performed here but

we recommend waiting until after the primary antibody incubation. See Day 2, step 2 and note v.).

2. Wash the slides 2 x 5 minutes in TBS plus 0.025% Triton X-100 with gentle agitation. (See note i).

3. Block in 10% normal serum with 1% BSA in TBS for 2 hours at room temperature (See note iii).

4. Drain slides for a few seconds (do not rinse) and wipe around the sections with tissue paper (See note iv).

5. Apply primary antibody diluted in TBS with 1% BSA (See note v).

6. Incubate overnight at 4°C (See note iv).

Day 2

1. Rinse 2 x 5min TBS 0.025% Triton with gentle agitation.

2. If using an HRP conjugate for detection, incubate the slides in 0.3% H2O2 in TBS for 15 min (See note v.).

3. For enzymatic detection (HRP or AP secondary conjugates):

Apply enzyme-conjugated secondary antibody to the slide diluted to the concentration recommended by

the manufacturer in TBS with 1% BSA, and incubate for 1 hour at room temperature.

For fluorescent detection:

4. Rinse 3 x 5min TBS.

If using fluorescent detection, end at this step and coverslip with mounting medium.

If visualizing the protein with a chromogen, continue with the following steps.

5. Develop with chromogen for 10 min at room temperature (See note vi.).

6. Rinse in running tap water for 5 min.

7. Counterstain (if required) (See note vii.).

8. Dehydrate, clear and mount (See notes ix. and x.).

Bitte zögern Sie nicht mit den zusätzlichen Informationen auf mich zurück zu kommen. Der vermutlich wichtigste erste Schritt ist zu überprüfen welcher der beiden Antikörper nicht funktioniert.

Ich hoffe ich konnte Ihnen etwas weiter helfen und freue mich auf Ihre Antwort.